綠蘿花黃酮對糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度及NF-κB信號通路的影響

陳明霞，馬 雪，陳佩文，冷 偉

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)為遠(yuǎn)端神經(jīng)的感覺和運動神經(jīng)障礙，治療上在控制血糖同時以營養(yǎng)神經(jīng)和改善微循環(huán)為主[1-2]。DPN的病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為是由于慢性高血糖、氧化應(yīng)激等引起缺血缺氧，破壞微血管進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，最終出現(xiàn)周圍神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘和軸突萎縮，引發(fā)周圍神經(jīng)功能障礙[3-4]。因此，改善DPN運動、感覺障礙是當(dāng)前治療DPN的臨床目標(biāo)。中醫(yī)認(rèn)為DPN屬“消渴”“痹癥”等范疇，以氣血陰陽虧虛為本，痰濁瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)為標(biāo)，中藥治療對于改善DPN具有一定療效[5]。近年來，中藥的活性成分因其豐富的藥理作用和較少的不良反應(yīng)一直成為DPN藥物開發(fā)的熱門，其中黃酮類化合物更是受到廣泛關(guān)注，兒茶素和木犀草素均對DPN中坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度具有較好的改善作用，黃芩素具有改善熱痛覺減退的作用[6]。藏藥綠蘿花中含有多種活性成分，包括黃酮類、香豆素等，對糖尿病、心血管疾病以及癌癥等均具有一定的治療作用[7]。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)綠蘿花水提物可改善棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2肝細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素抵抗。王潔雪等[9]也發(fā)現(xiàn)綠蘿花中的綠蘿花苷等化合物可抑制α-葡萄糖苷酶活化?；谝陨献C據(jù)研究組推測綠蘿花總黃酮對DPN具有治療作用。本研究以DPN小鼠為研究對象，探討綠蘿花對其運動、感覺障礙的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：90只SPF級C57BL/6雄性小鼠，6周齡，體重18～22 g，3只SPF級C57BL/6乳鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號 SCXK(京)2021-0006。動物飼養(yǎng)溫度濕度適宜，自由飲食，實驗經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，符合實驗動物3R原則。

1.1.2 藥品與試劑：綠蘿花總黃酮(陜西森元生物科技有限公司)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京索萊寶科技有限公司)，RIPA裂解液、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin 1β，IL-1β)小鼠ELISA檢測試劑盒、Trizol(武漢博士德生物工程有限公司)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)p65、kappa B抑制因子激酶β(Inhibitor of kappa B kinase β,IKKβ)、IKKα、p-IKKβ、p-IKKα抗體(Abcam公司)，PCR引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)，PCR試劑盒(Takara公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模和干預(yù)：將90只C57BL/6小鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組10只和高脂高糖組80只，空白組小鼠給予普通飼料，高脂高糖組小鼠換為高脂飼料飼養(yǎng)5周，除空白組外其余小鼠均按照文獻(xiàn)[10]復(fù)制DPN小鼠模型，造模前禁食12 h，腹腔注射1% STZ檸檬酸鹽緩沖溶液(100 mg/kg)，空白組腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖溶液，72 h后對小鼠進(jìn)行禁食12 h，檢測尾靜脈血糖，若血糖>16.7 mmol/L即為造模成功。將造模成功的65只小鼠隨機(jī)按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、阿卡波糖組和綠蘿花總黃酮高、中、低劑量組各13只，第2 天開始藥物干預(yù)，期間除空白組外其余組小鼠仍給予高脂飼料，空白組給予普通飼料，阿卡波糖組以阿卡波糖150 mg/kg灌胃，綠蘿花總黃酮高、中、低劑量組分別給予綠蘿花總黃酮200、100、50 mg/kg灌胃，空白組和模型組予以等體積0.9%氯化鈉水溶液灌胃，1次/d，持續(xù)40 d。分別在治療第10、20、40天時每組隨機(jī)選5只小鼠測體重及血糖指標(biāo)、運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNCV)、血清炎癥因子水平、坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)、坐骨神經(jīng)NF-κB信號通路蛋白表達(dá)水平。

1.2.2 MNCV和熱痛反應(yīng)敏感程度測定：將小鼠固定在熱痛測定儀塑料筒內(nèi)適應(yīng)20 min，光熱刺激小鼠尾部，記錄光熱刺激開始到甩尾間所用的時間即為熱痛反應(yīng)時間。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，剪開股二頭肌與半膜肌間皮膚，暴露坐骨神經(jīng)，測量MNCV時將刺激電極插入小鼠右側(cè)坐骨切跡，記錄電極分別插入小鼠踝部和左足底第2趾間，測量感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNCV)時將刺激電極置于同側(cè)足背，記錄電極放置在近端坐骨切跡處，用Power Lab生理記錄儀記錄復(fù)合動作電位，從開始刺激到誘發(fā)電位出現(xiàn)的時間為潛伏期。MNCV=兩記錄電極間距離/潛伏期之差，SNCV=刺激電極與記錄電極間距離/潛伏期。

1.2.3 ELISA檢測炎癥因子水平：運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度和熱痛反應(yīng)敏感程度測定后進(jìn)行心臟采血，靜置2 h后6000 r/min離心15 min分離血清，采用ELISA法檢測小鼠血清TNF-α、IL-1β含量。預(yù)包被抗原的96孔板中加入血清稀釋液和HRP酶標(biāo)抗體，室溫震蕩孵育60 min，洗板后甩去多余液體，按照試劑盒說明書要求加入顯色液后避光反應(yīng)20 min，加入終止液終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度。樣本濃度=(樣本吸光度/標(biāo)準(zhǔn)品吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.2.4 HE染色觀察病理學(xué)改變：小鼠處死后在無菌操作臺上分離坐骨神經(jīng)，一部分用10%中性福爾馬林固定48 h，一部分保存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)檢測。將坐骨神經(jīng)條經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋處理，然后在切片機(jī)上將石蠟塊切成厚度約4 μm的薄片，再經(jīng)切片脫蠟、蘇木素-伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟，用光學(xué)顯微鏡觀察坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)的變化。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平：坐骨神經(jīng)組織加入RIPA裂解液勻漿后，低溫高速離心30 min，取上清液，測定蛋白濃度并定量，水浴變性。配制10%分離膠和5%濃縮膠，上樣后以80 V初始電壓進(jìn)行電泳，Maker下至分離膠上緣后將電壓轉(zhuǎn)至100 V，繼續(xù)電泳Maker位于分離膠下緣，以恒流30 mA電轉(zhuǎn)60 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育分別孵育一抗(1∶500)過夜，室溫孵育二抗(1∶5000)1 h后顯色，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 RT-qPCR檢測mRNA相對表達(dá)量：Trizol法提取坐骨神經(jīng)總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR檢測目的基因mRNA相對表達(dá)量，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，計算2-△△Ct即為mRNA相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.7 乳鼠坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞原代培養(yǎng)與干預(yù)：脫頸處死乳鼠，75%乙醇消毒，無菌操作臺上分離坐骨神經(jīng)，置于含D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中剝離神經(jīng)外膜和束膜后將組織剪碎，加入工作培養(yǎng)基浸沒組織，接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取第3代增殖良好的施萬細(xì)胞換為含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至對數(shù)生長期用于實驗。將施萬細(xì)胞分為正常組、LPS組、LPS+阿卡波糖組、LPS+綠蘿花總黃酮高、中、低劑量組，接種于96孔板中培養(yǎng)過夜(1×105/ml)，細(xì)胞貼壁后開始干預(yù)，LPS組加入LPS(1 μg/ml)，LPS+阿卡波糖組同時加入阿卡波糖(40 μg/ml)和LPS，LPS+綠蘿花總黃酮高、中、低劑量組分別同時加入綠蘿花總黃酮(80、40、20 μg/ml)和LPS，正常組加入等體積DMEM培養(yǎng)基，分別在12、24、48 h后用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6分泌情況，Western blot檢測NF-κB p65、IKKβ、IKKα、p-IKKβ、p-IKKα蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測NF-κB、IKKβ、IKKα、NF-κB p65的mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 綠蘿花黃酮對DPN小鼠體重和血糖水平影響 造模后，血糖<16.7 mmol/L而未成功造模的小鼠有15只，其中有6只死亡，治療期間均無動物死亡，造模成功率為81.25%，動物病死率為6.70%。治療40 d期間，空白組和綠蘿花黃酮低劑量組小鼠體重血糖水平變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組小鼠體重逐漸降低(P<0.05)，血糖水平逐漸升高(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠體重逐漸升高(P<0.05)，血糖水平逐漸降低(P<0.05)；治療第10天，與空白組比較，模型組小鼠體重顯著降低(P<0.05)，血糖水平顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，其余各治療組小鼠體重和血糖水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療第20、40天，與空白組比較，模型組小鼠體重均顯著降低(P<0.05)，血糖水平均顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠體重均升高(P<0.05)，血糖水平均降低(P<0.05)。見表2。

表2 綠蘿花黃酮對DPN小鼠體重和血糖水平影響

2.2 綠蘿花黃酮對DPN小鼠運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度和熱痛反應(yīng)敏感程度的影響 治療40 d期間，空白組小鼠熱痛反應(yīng)時間、坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組和綠蘿花黃酮低劑量組小鼠熱痛反應(yīng)時間逐漸降低(P<0.05)，坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠熱痛反應(yīng)時間、坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV均逐漸升高(P<0.05)；治療第10 天，與空白組比較，模型組小鼠熱痛反應(yīng)時間、坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV均顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高劑量組熱痛反應(yīng)時間和坐骨神經(jīng)SNCV均延長(P<0.05)，綠蘿花黃酮中劑量組坐骨神經(jīng)SNCV延長(P<0.05)，其余各項變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療第20、40天，與空白組比較，模型組小鼠熱痛反應(yīng)時間、坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV均顯著降低(P<0.05)，與模型組比較，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠熱痛反應(yīng)時間、坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV均顯著降低均升高(P<0.05)，綠蘿花黃酮低劑量組小鼠各項變化比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 綠蘿花黃酮對DPN小鼠運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度和熱痛反應(yīng)敏感程度的影響

2.3 綠蘿花黃酮對DPN小鼠坐骨神經(jīng)病理改變和血清炎癥因子水平的影響 治療40 d期間，空白組小鼠坐骨神經(jīng)未出現(xiàn)明顯病理改變，有髓神經(jīng)纖維排列有序，形態(tài)正常，模型組可觀察到明顯結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)髓鞘脫失、軸突萎縮，且神經(jīng)纖維排列紊亂松散，出現(xiàn)散在空洞，還可觀察到神經(jīng)纖維斷裂，阿卡波糖和綠蘿花黃酮各劑量組在治療后上述情況均得到不同程度改善，且隨治療時間延長改善愈發(fā)明顯。比較治療40 d期間各組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平，空白組變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組和綠蘿花黃酮低劑量組逐漸升高(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠逐漸降低(P<0.05)；各時間點，模型組小鼠均低于空白組(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中、劑量組高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(表4)。

表4 綠蘿花黃酮對DPN小鼠血清炎癥因子水平的影響(ng/ml)

圖1 綠蘿花黃酮對DPN小鼠坐骨神經(jīng)病理改變的影響

2.4 綠蘿花黃酮對DPN小鼠NF-κB信號通路的影響 治療40 d期間，模型組和綠蘿花黃酮低劑量組小鼠坐骨神經(jīng)中NF-κB p65蛋白表達(dá)量和p-IKKβ/IKKβ、p-IKKα/IKKα比值以及NF-κB、IKKβ、IKKα、NF-κB p65的mRNA相對表達(dá)量隨治療時間延長逐漸升高(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠坐骨神經(jīng)上述指標(biāo)隨治療時間延長逐漸降低(P<0.05)，空白組各項指標(biāo)變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各時間點，模型組小鼠血清坐骨神經(jīng)的上述指標(biāo)均高于空白組(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組小鼠坐骨神經(jīng)上述指標(biāo)均低于模型組(P<0.05)，綠蘿花黃酮低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.5 綠蘿花黃酮對NF-κB信號通路的體外干預(yù)作用 干預(yù)48 h期間，模型組和綠蘿花黃酮低劑量組坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞TNF-α和IL-1β水平、NF-κB p65蛋白表達(dá)量和p-IKKβ/IKKβ、p-IKKα/IKKα比值以及NF-κB、IKKβ、IKKα、NF-κB p65的mRNA相對表達(dá)量逐漸升高(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞上述項目除均逐漸降低(P<0.05)，IL-1β水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，空白組各項指標(biāo)變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各時間點，模型組細(xì)胞上述指標(biāo)均高于空白組(P<0.05)，阿卡波糖組和綠蘿花黃酮高、中劑量組坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞上述指標(biāo)均低于模型組(P<0.05)，綠蘿花黃酮低劑量組與模型組比較各項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5(圖3)。

A：治療40 d各組NF-κB信號通路相關(guān)蛋白條帶(1：空白組；2：模型組；3：阿卡波糖組；4：綠蘿花黃酮高劑量組；5：綠蘿花黃酮中劑量組；6：綠蘿花黃酮低劑量組)；B～D：各組NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較；E～H：各組NF-κB信號通路相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較。與同組治療第10天比較，*P<0.05；與同組治療第20天比較，#P<0.05；與空白組同時間比較，△P<0.05；與模型組同時間比較，▲P<0.05

表5 綠蘿花黃酮對施萬細(xì)胞血清炎癥因子水平的影響(pg/ml)

3 討 論

DPN引起神經(jīng)纖維脫髓鞘是周圍神經(jīng)運動、感覺障礙的主要原因，在神經(jīng)傳導(dǎo)研究中測量的所有參數(shù)中，SNCV被用來確定感覺神經(jīng)狀態(tài)，由于感覺神經(jīng)纖維脫髓鞘使SNCV減慢，因此能SNCV準(zhǔn)確反映髓鞘完整性，而MNCV反映了運動神經(jīng)纖維髓鞘的完整性[11]。本研究中，綠蘿花總黃酮治療DPN小鼠的40 d期間，小鼠體重逐漸增加，血糖水平不斷降低，且熱痛反應(yīng)時間、坐骨神經(jīng)MNCV和SNCV也逐漸延長，表明綠蘿花總黃酮可降低DPN小鼠血糖水平，改善周圍神經(jīng)病變。值得注意的是在治療第10天時，小鼠坐骨神經(jīng)MNCV改善效果不明顯，且中劑量綠蘿花總黃酮僅對坐骨神經(jīng)SNCV具有改善作用。黃酮類化合物對DPN運動、感覺障礙的改善作用也具有差異性，例如山奈酚僅能提升MNSV[12]，這一差異與可能藥物作用機(jī)制不同有關(guān)，因此研究組認(rèn)為綠蘿花黃酮對DPN小鼠SNCV的短期療效優(yōu)于MNCV，而長期來看綠蘿花黃酮對DPN引起的運動、感覺神經(jīng)功能障礙具有較好的療效。

炎癥反應(yīng)與DPN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血糖長期處于高水平可激活免疫細(xì)胞分泌TNF-α，一方面加速脂肪分解，促進(jìn)肝糖原產(chǎn)生，引起胰島素抵抗和神經(jīng)缺血缺氧，進(jìn)而損傷神經(jīng)，另一方面TNF-α引起神經(jīng)脫髓鞘，刺激單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性物質(zhì)，引起神經(jīng)炎癥[13]。氧化應(yīng)激是引起DPN的原因之一，氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的活性氧激活NLRP3炎癥小體，然后激活Caspase-1將IL-1β前體切割成為IL-1β并釋放到細(xì)胞外引起炎癥反應(yīng)[14]，DPN患者外周血中IL-1β水平較高，且有NLRP3 mRNA高表達(dá)[15]，而周雯等[16]在DPN大鼠中觀察到了類似的結(jié)果。Cheng等[17]通過抑制氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體激活減輕高糖誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞焦亡，與本研究的體內(nèi)外實驗均觀察到綠蘿花黃酮干預(yù)后TNF-α和IL-1β水平降低的結(jié)果一致，雖然體外研究中，施萬細(xì)胞IL-1β水平在48 h內(nèi)無明顯變化，但均明顯低于模型組，且DPN小鼠坐骨神經(jīng)纖維脫髓鞘、軸突萎縮明顯改善，表明綠蘿花黃酮通過降低TNF-α和IL-1β水平，減輕坐骨神經(jīng)炎癥，改善坐骨神經(jīng)損傷。

NF-κB信號通路是目前研究最為廣泛的炎癥通路，NF-κB通路由IKK激活，其中IKKβ主要激活經(jīng)典NF-κB信號通路，IKKα主要調(diào)控非經(jīng)典NF-κB信號通路，而NF-κB p65則是NF-κB二聚體的組成部分[18]。NF-κB二聚體進(jìn)入核內(nèi)，與其多種靶基因結(jié)合從而參與多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，如IL-1β、IL-6、TNF-α等。NF-κB信號通路與DPN發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其介導(dǎo)的促炎反應(yīng)可造成DPN進(jìn)一步惡化。Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)槲皮素通過下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善DPN大鼠運動、感覺功能障礙和炎癥因子水平。Adki等[20]發(fā)現(xiàn)丹皮酚通過抑制坐骨神經(jīng)NF-κB和MCP-1表達(dá)改善DPN。本研究體內(nèi)外實驗均顯示綠蘿花黃酮能通過抑制IKKβ和IKKα激活，進(jìn)而抑制NF-κB二聚體形成和NF-κB信號通路激活，與過去的研究結(jié)果類似。

綜上所述，綠蘿花黃酮可降低DPN小鼠血糖水平，改善運動、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度，減輕坐骨神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可能與抑制NF-κB信號通路激活相關(guān)。