薄殼山核桃原花青素合成關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析

賈展慧，賈曉東，許夢(mèng)洋，莫正海，翟 敏，宣繼萍，張計(jì)育，王 剛，王 濤, 郭忠仁

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái),江蘇 南京 210014)

薄殼山核桃(Caryaillinoinensis)是世界上重要的干果樹(shù)種之一，含有豐富的酚類(lèi)物質(zhì)[1]。Villarreal-Lozoya等[2]發(fā)現(xiàn)在成熟的薄殼山核桃種仁中主要的酚類(lèi)物質(zhì)是鞣花酸和沒(méi)食子酸，以及少量的兒茶素(catechin, C)和表兒茶素(epicatechin, EC)。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，兒茶素、表兒茶素及由兩者縮合形成的原花青素(proanthocyanidins，PAs)是薄殼山核桃未成熟期種仁中的主要酚類(lèi)成分，含量是其他酚類(lèi)物質(zhì)的數(shù)倍[3]。原花青素又稱(chēng)縮合單寧，是植物體內(nèi)重要的黃酮類(lèi)化合物，不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、防護(hù)紫外光輻射和防御病蟲(chóng)害等有著重要作用，而且是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基有效的天然抗氧化劑，已成為抗氧化、抗衰老和預(yù)防氧化相關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)。

原花青素生物合成起始于苯丙氨酸，二氫黃烷酮4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是該途徑中合成花青素、兒茶素和原花青素的上游關(guān)鍵酶。該基因可將二氫黃酮醇還原為相應(yīng)的黃烷-3, 4-二醇(無(wú)色花青素，leucoanthocyanidins)。DFR屬于NADPH依賴(lài)性短鏈還原酶家族或者是 DFR 亞家族，一般以單基因或小基因家族的形式出現(xiàn)在植物中，最早從玉米(Zeamays)和金魚(yú)草(Antirrhinummajus)中克隆得到[4-5]。由無(wú)色花青素合成原花青素屬于核心類(lèi)黃酮途徑，經(jīng)無(wú)色花青素還原酶(leucoanthocyanidin reductase, LAR)途徑和花青素還原酶(anthocyanidin reductase, ANR)途徑通過(guò)多酶促反應(yīng)完成，在許多植物中已有過(guò)研究。LAR途徑指由LAR還原無(wú)色花青素形成2，3-反式黃烷-3-醇(兒茶素)，然后縮合成原花青素[6]。LAR是兒茶素形成的關(guān)鍵酶，最早在豆科植物金錢(qián)草(Desmodiumuncinatum) 的葉片中克隆得到[7]；ANR途徑指由花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)催化將無(wú)色花青素還原成2，3-順式黃烷-3-醇(表兒茶素)，然后聚合成原花青素[8-9]。ANR是表兒茶素形成的關(guān)鍵酶，屬于DFR超家族的脫氫酶類(lèi)[10-11]。首先在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中分離得到ANR基因，編碼342個(gè)氨基酸，與DFR有較高的相似性。多數(shù)植物同時(shí)具有LAR和ANR基因，能同時(shí)合成兒茶素和表兒茶素。

Jia等[3]研究發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃未成熟種仁的強(qiáng)抗氧化性與高含量的兒茶素類(lèi)物質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，但在成熟種仁中，兒茶素類(lèi)物質(zhì)含量快速下降，而抗氧化活性并不低。推測(cè)可能是由(表)兒茶素形成的原花青素隨著種仁發(fā)育逐漸積累，成為后期抗氧化性的主要來(lái)源。Robbins等[12]報(bào)道薄殼山核桃成熟種仁中兒茶素二聚體、三聚體、四至六聚體的含量分別為47.%、21.1%和14.8%，因此原花青素單體(兒茶素類(lèi)物質(zhì))可能是薄殼山核桃酚類(lèi)物質(zhì)代謝途徑的重要前體物質(zhì)。目前對(duì)于原花青素分支代謝通路，尤其是縮合過(guò)程的研究仍不透徹。筆者在薄殼山核桃果實(shí)品質(zhì)形成期種仁的轉(zhuǎn)錄組研究中獲得了3個(gè)編碼DFR的unigene序列、2個(gè)編碼LAR的unigene序列和1個(gè)編碼ANR的unigene序列[13]。因此，本研究借助轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，擬克隆薄殼山核桃兒茶素合成上游關(guān)鍵基因LAR，表兒茶素合成上游關(guān)鍵基因ANR，及兩者共同的上游關(guān)鍵基因DFR，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，以期為今后的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為薄殼山核桃‘波尼’(‘Pawnee’)，栽培于南京市六合區(qū)南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司生產(chǎn)基地(118.91°E,32.33°N)，樹(shù)齡8～12 a，株行距為5.0 m×7.0 m，選取生長(zhǎng)發(fā)育良好、樹(shù)勢(shì)相對(duì)一致的植株6株，2株為1個(gè)小區(qū)，重復(fù)3次。2014年于花后95～165 d每10 d每株按東、南、西和北4個(gè)方位，每個(gè)方位各取健康飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)2個(gè)，即每株取果實(shí)8個(gè)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含16個(gè)樣品，每個(gè)采樣日期取樣48個(gè)。取樣后放入冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品-20 ℃冰箱過(guò)夜，剖開(kāi)取種仁。將種仁在液氮中速凍混勻后，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

采用天根生化科技(北京)有限公司RNA simple Total RNA Kit試劑盒提取不同發(fā)育期的種仁總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和Onedrop光譜儀檢測(cè)確定總RNA的純度、濃度和完整性；采用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

將‘波尼’ 115和135 d種仁cDNA 混合后用于薄殼山核桃CiDFR、CiLAR和CiANR基因的克隆。不同發(fā)育期的種仁cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.2.2 基因的克隆與序列分析

借助轉(zhuǎn)錄組[12]所獲得的unigene序列設(shè)計(jì)引物：3個(gè)編碼DRF的unigene序列表達(dá)差異顯著，挑選其中高表達(dá)的1個(gè)DRF(comp 47692_c0)設(shè)計(jì)引物；2個(gè)編碼LAR的unigene序列無(wú)差異表達(dá)，挑選其中表達(dá)量較高的1個(gè)LAR(comp 59380_c0)設(shè)計(jì)引物。引物由上海英俊(Invitrogen)生物科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 薄殼山核桃引物序列

采用2 ×TaqMaster Mix 試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2 ×TaqMaster Mix 25 μL，上下游引物各2 μL (10 μmol/L)，模板cDNA 5 μL，補(bǔ)足ddH2O至終體積50 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)后再72 ℃延伸10 min。

采用Biospin瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，具體操作見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。取3 μL回收純化后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)回收DNA產(chǎn)物的質(zhì)量。回收產(chǎn)物與pMD?18-T載體(TaKaRa, Japan)連接并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室保存)，挑取單克隆菌落經(jīng)PCR驗(yàn)證(反應(yīng)程序和反應(yīng)體系同上)后，對(duì)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度合適的單克隆送南京集思慧遠(yuǎn)生物公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

克隆獲得的原花青素生物合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因的cDNA或氨基酸序列使用不同的網(wǎng)絡(luò)程序或本地軟件進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，即在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提交克隆序列，并運(yùn)行BlastN查找同源序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；再用BioXM查找序列的最大開(kāi)放閱讀框并推導(dǎo)氨基酸序列；而后用pI/Mw tool(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)、ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)和Kyte-Doolittle(http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1)分析相關(guān)蛋白的理化性質(zhì)，同時(shí)將推導(dǎo)的蛋白序列用SMART預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域、GOR預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)(http://smart.embl-heidelberg.de/)；用DNAman 7.0進(jìn)行多重序列比對(duì)，再用MEGA 5.1構(gòu)建鄰接樹(shù)，均用500次重復(fù)進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)，采用默認(rèn)的Poisson correction模型和Complete deletion選項(xiàng)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用Beacon designer 7.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(表2)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋15 倍作為模板，熒光定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR GreenReal-time PCR Master Mix (2x) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L) 1.0 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，加入ddH2O補(bǔ)足到20 μL。Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，連續(xù)檢測(cè)信號(hào)。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt法。利用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，P<0.05。

表2 RT-qPCR 使用的引物

1.2.5 酚類(lèi)代謝相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)量與酚類(lèi)代謝物含量的關(guān)聯(lián)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，之后采用MeV軟件繪制熱圖。繪制熱圖的數(shù)據(jù)包括：前期研究中測(cè)定的‘波尼’10個(gè)發(fā)育時(shí)期中的總酚含量、縮合單寧、總黃酮含量、兒茶素、表兒茶素、鞣花酸、沒(méi)食子酸、EGCG的含量和抗氧化性的動(dòng)態(tài)變化[3]，以及CiDFR、CiLAR和CiANR基因在‘波尼’8個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄殼山核桃CiDFR基因的克隆和序列分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度大約為1 200 bp的目的基因片段，測(cè)序結(jié)果為1 148 bp，其中包含1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 020 bp，編碼339個(gè)氨基酸。推導(dǎo)蛋白的分子質(zhì)量為37.97 ku，等電點(diǎn)(pI)為5.91，疏水指數(shù)為-0.234，說(shuō)明該蛋白偏親水性。該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為BankIt2133004 Seq3 MH613770。

薄殼山核桃CiDFR的氨基酸序列在NCBI上與其他植物的DFR氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖1A)發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃CiDFR與核桃(Juglansregia)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)和棗(Ziziphusjujuba)等植物的同源性均大于80%。

CiDFR.薄殼山核桃Carya illinoensis；JrDFR. 核桃Juglans regia(XP_018821154.1)；QsDFR.歐洲栓皮櫟Quercus suber(XP_023872027.1)；LfDFR.楓香Liquidambar formosana(AGT28278.1)；VvDFR.葡萄Vitis vinifera(NP_001268144.1)；ZjDRF.棗Ziziphus jujuba(XP_015884708.1)；DzDFR.榴蓮Durio zibethinus(XP_022769017.1)；PbDFR.蘋(píng)果梨Pyrus×bretschneideri(XP_009365091.1)；MdDFR.蘋(píng)果Malus domestica(AAO39816.1)；PaDFR.歐洲甜櫻桃Prunus avium(AJO67977.1)；CmDFR. 英國(guó)山楂Crataegus monogyna(AAX16491.1)； FaDFR.草莓Fragaria×ananassa(AHL46451.1)；CoDFR.黃麻Corchorus capsalaris(OMO75166.1)；TcDFR.可可Theobroma cacao(EOY14811.1)；PlDFR.芍藥Paeonia lactiflora(AFI71899.1)。紅色與綠色下劃線(xiàn)分別為NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性結(jié)合基序。兩個(gè)下拉箭頭表示保守位點(diǎn)。Red and green underlines represent the NADP(H)-binding site and the substrate specificity site。The two drop-down arrows indicate conserved sites.圖1 CiDFR氨基酸序列多重比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)行分析Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree constracting of amino acid homology of CiDFR in pecan

利用在線(xiàn)InterProScan程序檢索EBI的InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)該蛋白在N端存在一個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的且高度保守的NAD (P)結(jié)合位點(diǎn)‘VTGASGFIGSWLIMRLLEHGY’[14]，其中富含甘氨酸(G)的NAD (P)結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域(‘TGXXGXX’)允許NAD(P)進(jìn)入，對(duì)結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。另外還存在一個(gè)由26個(gè)氨基酸構(gòu)成的底物特異性結(jié)合的氨基酸基序“TVNVEEHQKPVYDESCWSDVEFCRAK”[15]，這段序列可以決定DRF底物的特異性，其中第103位的天冬酰胺(N) 和第114 位的谷氨酸(E) 直接影響DFR的底物特異性。進(jìn)一步搜索NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)，該基因在8～302 aa處含有FR_SDR_e結(jié)構(gòu)域，在1～329 aa處含有PLN02650結(jié)構(gòu)域。另外該蛋白還包含WcaG、HpnA、Epimerase等結(jié)構(gòu)域，其中WcaG為核苷二磷酸糖表異構(gòu)酶的保守結(jié)構(gòu)域，主要在細(xì)胞壁和膜酯等的合成中發(fā)揮作用，Epimerase為NAD依賴(lài)表異構(gòu)酶/脫氫酶家族共有的保守結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明此蛋白屬于二氫黃酮醇還原酶家族。

利用MEGA 5.1對(duì)薄殼山核桃及高同源性植物進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃與核桃親緣關(guān)系最近，其次是歐洲栓皮櫟和棗，然后是薔薇科的蘋(píng)果(Malusdomestica)、草莓(Fragaria×ananassa)和甜櫻桃(Prunusavium)等植物(圖1B)。

2.2 薄殼山核桃CiLAR基因的克隆和序列分析

薄殼山核桃CiLAR序列長(zhǎng)度為1 390 bp，包含1個(gè)長(zhǎng)度為1 050 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼349個(gè)氨基酸。推導(dǎo)蛋白的分子質(zhì)量為38.51 ku，等電點(diǎn)(pI)為5.77。平均親水性(GRAVY)值為-0.061，說(shuō)明該蛋白是一種親水蛋白。該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為BankIt2133004 Seq4 MH613771。

氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果(圖2A)表明，薄殼山核桃CiLAR的氨基酸序列與核桃的同源性最高，其次為歐洲栓皮櫟、楊梅(Morellarubra)和榴蓮(Duriozibethinus)等。通過(guò)比較不同物種的LAR氨基酸序列，結(jié)合NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃CiLAR蛋白中包含典型的苯(基)香豆素芐基醚還原酶(PCBER, phenylcoumaran benzylic ether reductase)的結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈脫氫/還原酶(SDR superfamily, short-chain dehvdrogenaselreductase)超家族成員。利用MEGA 5.1將薄殼山核桃LAR氨基酸序列與在NCBI中比對(duì)到的同源性最高的其他14種植物的LAR氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，與DFR情況一致，薄殼山核桃與核桃、歐洲栓皮櫟、楊梅的LAR進(jìn)化關(guān)系較近，與草莓、西洋梨(Pyruscommunis)、桃(Prunuspersica)和梅(Prunusmume)等薔薇科的植物的LAR進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2B)，說(shuō)明同科植物基因在進(jìn)化中相對(duì)保守，而不同科屬植物間的基因及氨基酸差異較大。

CiLAR.薄殼山核桃Carya illinoinensis；JrLAR.核桃Juglans regia(XP_018836086.1)；QsLAR.歐洲栓皮櫟Quercus suber(XP_023925115.1)；MrLAR.楊梅Morella rubra ((AIX02997.1)；DzLAR.榴蓮Durio zibethinus(XP_022777001.1)；HlLAR.啤酒花Humulus lupulus(AEV89964.1)；FaLAR.草莓Fragaria×ananassa(ABH07785.2)；TcLAR.可可Theobroma cacao(XP_017971349.1)；PcLAR.西洋梨Pyrus communis(ABB77696.1)；HbLAR.橡膠Hevea brasiliensis(XP_021682051.1);PpLAR. 桃Prunus persica(XP_007222274.1)；MnLAR. 桑樹(shù)Morus alba(XP_024019396.1)；VaLAR.兔眼藍(lán)莓Vaccinium ashei(BAM42674.1)；AcLAR.中華獼猴桃Actinidia chinensis var. chinensis(PSS13414.1)；PmLAR.梅Prunus mume(XP_008243165.1)。圖2 CiLAR氨基酸序列多重比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)行分析Fig.2 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree constructed of amino acid homology of CiLAR in pecan

2.3 薄殼山核桃CiANR基因的克隆和序列分析

薄殼山核桃CiANR序列長(zhǎng)度為1 104 bp，包含1個(gè)長(zhǎng)度為1 014 bp的ORF，編碼337個(gè)氨基酸。推導(dǎo)蛋白的分子質(zhì)量為36.35 ku，等電點(diǎn)(pI)為6.10。GRAVY值為0.064，說(shuō)明該蛋白是一種疏水蛋白。該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為BankIt2133004 Seq5 MH613772。

通過(guò)NCBI的BLASTp分析發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃CiANR的氨基酸序列與核桃的同源性最高，其他同源性較高的植物有歐洲栓皮櫟、櫻桃李(Prunuscerasifera)、桃等，同源性均大于80%，多重比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3A。通過(guò)NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白中也包含有與DFR類(lèi)似的FR_SDR_e、WcaG、HpnA和Epimerase等保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還含有PLN00198(原花青素還原酶)的結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 5.1對(duì)薄殼山核桃和高同源性植物進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃與核桃的進(jìn)化關(guān)系最近，而與茶(Camelliasinensis)、美麗葡萄(Vitisbellula)和葡萄(Vitisvinifera)的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3B)。

CiANR.薄殼山核桃Carya illinoensis;；JrANR.核桃Juglans regia(XP_018805546.1)；QsANR.歐洲栓皮櫟Quercus suber(XP_023876696.1)；PcANR.紅葉李Prunus cerasifera(AKV89239.1)；PpANR.桃Prunus persica(XP_007213813.1)；VbANR.美麗葡萄Vitis bellula(AFG28175.1)；MrANR.楊梅Morella rubra(AIX02996.1)；PaANR.歐洲甜櫻桃Prunus avium(XP_021828308.1)；VvANR.葡萄Vitis vinifera(NP_001267885.1)；PnANR.黑楊Populus nigra(ART94427.1)；PmANR. 梅Prunus mume(XP_008224881.1)；GhANR.棉花Gossypium hirsutum(ABM64802.1)；MdANR.蘋(píng)果Malus domestica(NP_001280930.1)；TcANR.可可Theobroma cacao(XP_007025907.2)；CsANR. 茶Camellia sinensis(ADF43751.1)。圖3 CiANR氨基酸序列多重比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree constructed of amino acid homology of CiANR in pecan

2.4 薄殼山核桃CiDFR、CiLAR和CiANR基因的表達(dá)特性

利用克隆得到的基因序列設(shè)計(jì)引物，采用熒光定量PCR檢測(cè)各基因在薄殼山核桃種仁發(fā)育中后期(95～165 d)各采樣點(diǎn)的表達(dá)量見(jiàn)圖4。

圖4 薄殼山核桃CiDFR、CiLAR和CiANR基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Changes of relative expression of CiDFR, CiLAR and CiANR gene in pecan

從結(jié)果(圖4)中可看出，CiDFR與CiANR基因在種仁發(fā)育中期(95～105 d)表達(dá)量較高，之后快速下降至較低值。而CiLAR基因在95 d表達(dá)量較高，之后快速降低，在種仁發(fā)育后期(135～155 d)表達(dá)量又逐漸升高，在155 d回到峰值。

2.5 原花青素生物合成關(guān)鍵酶相關(guān)基因表達(dá)量與酚類(lèi)代謝物含量的關(guān)聯(lián)分析

以8個(gè)發(fā)育時(shí)期的原花青素生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與酚類(lèi)代謝物含量數(shù)據(jù)為對(duì)象，進(jìn)行相關(guān)性熱圖的繪制(圖5)。從熱圖中可看出，DFR與ANR顯著正相關(guān)，而LAR與DFR、ANR均不顯著相關(guān)。DFR和ANR均與TPC、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸、EGCG和DPPH顯著正相關(guān)，而LAR除與ABTS顯著正相關(guān)外，與CT、TFC和鞣花酸為負(fù)相關(guān)，與其他變量均為正相關(guān)。綜上可看出，DFR、ANR表達(dá)量與酚類(lèi)代謝物含量變化相關(guān)性較強(qiáng)，而LAR相關(guān)性較弱，即DFR、ANR表達(dá)量高時(shí)酚類(lèi)物質(zhì)含量也較高，DFR、ANR表達(dá)量低時(shí)酚類(lèi)物質(zhì)含量也較低。

DFR. CiDFR在qRT-PCR中的表達(dá)量 relative expression values by RT-qPCR of CiDFR；LAR.CiLAR在qRT-PCR中的表達(dá)量relative expression values by qRT-PCR of CiLAR；ANR.CiANR在qRT-PCR中的表達(dá)量relative expression values by qRT-PCR of CiANR；TPC.總酚含量total phenolic content；CT.縮合單寧condensed tannin；TFC.總黃酮含量total flavone content；C.兒茶素catechin；EC.表兒茶素epicatechin；EA.鞣花酸ellagic acid；GC.沒(méi)食子酸gallic acid；EGCG.表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯epigallocatechin gallate。圖5 薄殼山核桃酚類(lèi)代謝相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)量與酚類(lèi)代謝物含量的相關(guān)性熱圖Fig.5 Heat map of the expression values of key candidate genes involved in phenolic synthesis of pecan with phenolic content

3 討 論

筆者前期通過(guò)對(duì)薄殼山核桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，篩選出可能影響薄殼山核桃原花青素生物合成的關(guān)鍵候選基因DFR、LAR和ANRunigene片段[12]。本研究克隆獲得了薄殼山核桃CiDFR、CiDFR和CiDFR基因cDNA片段，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和種仁發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)分析。

DFR是原花青素生物合成途徑的上游關(guān)鍵酶，可將二氫黃烷醇還原為無(wú)色花色素。無(wú)色花色素是花色素苷、兒茶素和原花色素合成的共同前體，因此，DFR決定了花青素和原花青素通路的量，對(duì)植物體中兒茶素合成起關(guān)鍵作用。在本試驗(yàn)中，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了編碼339個(gè)氨基酸的CiDFR開(kāi)放閱讀框，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因序列包含保守的NAD (P)結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性結(jié)合位點(diǎn)，屬于二氫還原酶基因家族。DRF在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的輔助下，可選擇性地催化3種二氫黃酮醇(DHK、DHQ和DHM)形成相應(yīng)的不穩(wěn)定無(wú)色花青素。早期的研究發(fā)現(xiàn)DFR基因保守的底物特異性區(qū)域中，第134位氨基酸和第145位的氨基酸會(huì)直接影響到DFR的底物特異性。大多數(shù)植物的DFR在第l34位是天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)，在145位大多是谷氨酸(E)，能有效地把DHK還原為天竺葵色素。而一些植物的DFR，如矮牽牛(Petuniahybrida)和蘭花(Cymbidiumhybrida)，在134位和145位分別是天冬氨酸(D)和谷氨酰胺(Q)，可催化DHQ和DHM，但不能以DHK為底物[16-17]。在本試驗(yàn)中，CiDFR的第103位為天冬酰胺(N)，第114 位為谷氨酸(E)，推測(cè)它們與其他植物的第134位和第145位相對(duì)應(yīng)，能以DHK為底物。但Petit等[18]對(duì)葡萄DFR酶的晶體結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為，DFR對(duì)底物的識(shí)別不能完全依賴(lài)于DFR酶的134位氨基酸。因此，后期還需要對(duì)其進(jìn)行一系列酶活性分析進(jìn)一步確定。

DFR作為原花青素和花青素合成途徑的關(guān)鍵酶在茶(Camelliaspp.)以及一些觀賞植物，尤其是觀花植物中得到了大量研究。當(dāng)DFR功能遭到破壞后，植物體花青素和原花青素的含量明顯下降，而轉(zhuǎn)入DFR基因后花青素和原花青素的含量明顯上升[19-20]。不同發(fā)育階段植物DFR基因的特性表達(dá)具有一定的差異。DFR基因在白茶(Camelliasinensiscv. Fuding-dabaicha)萎凋32 h表達(dá)量最高，而后表達(dá)量逐漸降低[21]；葡萄風(fēng)信子(Muscaribotryoides)的2個(gè)DFR基因，MaDFR2a和MaDFR2b都在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并在完全著色的花蕾(S3)時(shí)期表達(dá)量達(dá)到峰值，此后隨著花色變淡，表達(dá)量逐漸降低[22]；菊花(Chrysanthemumspp.)DFR基因在舌狀花初顯、伸長(zhǎng)及花瓣伸長(zhǎng)時(shí)表達(dá)量增高，而后隨著花序的開(kāi)放表達(dá)量逐漸下降[23]；桂花(Qsmanthusfragrans)OfDFR基因的表達(dá)量隨花期呈現(xiàn)先上后下降的趨勢(shì)，初花期表達(dá)量最高，隨后顯著下降，盛花期表達(dá)水平降低[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃CiDFR基因在種仁發(fā)育中期(95～105 d)表達(dá)量高，之后顯著下降。這與前期轉(zhuǎn)錄組研究中編碼該DFR的unigene在種仁發(fā)育中期表達(dá)量最高相一致，說(shuō)明了CiDFR在薄殼山核桃酚類(lèi)代謝中非?；钴S，發(fā)揮重要作用。

LAR基因以單拷貝或多拷貝存在，而翻譯后的LAR酶屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族和PIP家族[25]。筆者克隆獲得的CiLAR蛋白中包含典型的苯(基)香豆素芐基醚還原酶的結(jié)構(gòu)域，證明屬于短鏈脫氫/還原酶超家族成員。LAR直接催化無(wú)色花青素(黃烷-3,4-二醇)轉(zhuǎn)化為兒茶素(C)和沒(méi)食子兒茶素(GC)[6]，其表達(dá)量的高低與兒茶素的含量直接相關(guān)。Li等[26]將玉米(Zeamays)中的 Lc(leafcolour)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入蘋(píng)果植株中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中LAR的表達(dá)量升高，且兒茶素大量積累。在轉(zhuǎn)LAR基因煙草中，外源LAR基因的過(guò)量表達(dá)并沒(méi)有使原花青素和兒茶素積累增加[27]。在模式植物擬南芥中未發(fā)現(xiàn)LAR，并只能合成表兒茶素[28-29]。大量研究表明，LAR基因具有很強(qiáng)的組織和時(shí)空表達(dá)的特異性。對(duì)金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)根莖不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中LAR基因的表達(dá)量和類(lèi)黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LAR與類(lèi)黃酮的積累有關(guān)，但在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段LAR的表達(dá)量和類(lèi)黃酮的積累與在生殖生長(zhǎng)階段表現(xiàn)卻不同[30]。在葡萄種子和果皮中，兒茶素的含量與LAR基因表達(dá)量會(huì)隨著果實(shí)的發(fā)育呈現(xiàn)一致的規(guī)律性變化[31]。在筆者的研究中，CiDFR在薄殼山核桃種仁發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)升高—降低—升高的趨勢(shì)，并與兒茶素和沒(méi)食子酸呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明LAR與兒茶素的合成緊密相關(guān)。

表兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素(epicatechin gallate, EGC)分別是花青素還原酶(ANR)的直接產(chǎn)物。本研究預(yù)測(cè)的CiANR保守結(jié)構(gòu)域與CiDFR基本類(lèi)似，說(shuō)明ANR與DFR結(jié)構(gòu)與功能類(lèi)似，這與擬南芥中的結(jié)果一致[10-11]。Xie等[32]將蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的MtANR基因和PAP1基因轉(zhuǎn)入煙草體內(nèi)進(jìn)行共表達(dá)，煙草葉片中兩個(gè)基因均有表達(dá)，兒茶素和表兒茶素含量增加。超量表達(dá)茶樹(shù)CsANR基因，轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)黃烷增加而花青素減少，花色變白[33]，說(shuō)明表兒茶素與花青素的合成存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，ANR的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致花青素含量減少而表兒茶素或原花青素含量增加。此外，ANR基因在不同時(shí)期表達(dá)量也有差異。葡萄的花和果實(shí)在發(fā)育的過(guò)程中，VvANR基因表達(dá)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，原花青素積累，但在果實(shí)成熟的時(shí)候幾乎檢測(cè)不到VvANR基因的表達(dá)[34]。在轉(zhuǎn)錄層面上，CiANR的表達(dá)趨勢(shì)與CiDFR一致，其在種仁發(fā)育中期(95～105 d)表達(dá)量到達(dá)峰值，之后急劇下降。

CiDFR與CiANR基因在兒茶素代謝過(guò)程中的密切相關(guān)性經(jīng)關(guān)聯(lián)分析也得到了印證，兩者與酚類(lèi)代謝物含量變化相關(guān)性較強(qiáng)，而CiLAR基因與酚類(lèi)代謝物含量變化的相關(guān)性較弱。在金花茶(Camelliapetelotii)的研究中表明，DFR與LAR在兒茶素代謝過(guò)程中密切相關(guān)，并且在不同苯丙氨酸添加量處理下，DFR與LAR表達(dá)量變化均與總兒茶素含量變化呈顯著正相關(guān)關(guān)系[35]。而本研究的結(jié)果與之不同，CiLAR與CiDFR的相關(guān)性較差，與種仁中兒茶素的變化趨勢(shì)也不一致。種仁中兒茶素的含量在酚類(lèi)物質(zhì)中最多，且在種仁發(fā)育中期最高，之后快速降低至較低值[3]。CiLAR基因的表達(dá)量在種仁發(fā)育的中期(95 d)及后期(155 d)均出現(xiàn)一個(gè)高峰，前者可能與兒茶素的大量合成有關(guān)，而后者說(shuō)明CiLAR基因極有可能除了在兒茶素的合成途徑中發(fā)揮作用外，還在其他酚類(lèi)物質(zhì)的合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這有待今后進(jìn)行進(jìn)一步研究。