小柴胡湯及亞胺培南西司他丁對(duì)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的體外抑菌效果及生物膜清除作用的機(jī)制研究

高 吟, 張立紅, 張志斌, 胡錫池

(1.江蘇省無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 江蘇 無(wú)錫, 214000;2.江蘇省無(wú)錫市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 江蘇 無(wú)錫, 214000)

鮑曼不動(dòng)桿菌是革蘭陰性條件致病菌, 無(wú)鞭毛，幾乎無(wú)動(dòng)力，在大自然中廣泛存在[1]。鮑曼不動(dòng)桿菌是重癥監(jiān)護(hù)室院內(nèi)感染主導(dǎo)細(xì)菌之一[2]?？股氐臑E用易導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生多重耐藥性[3]。耐碳青霉烯類抗菌藥物對(duì)β-內(nèi)酰胺酶作用穩(wěn)定，臨床上分離出耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)的數(shù)量逐年上升[4]。小柴胡湯出自東漢名醫(yī)張仲景所著《傷寒論》，由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗等中藥組成，可用于治療傷寒少陽(yáng)證，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[5-6]。本研究探討小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁對(duì)CRAB的體外抑菌效果及對(duì)生物膜的清除作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及藥物來(lái)源

本研究隨機(jī)選取江蘇省無(wú)錫市第二人民醫(yī)院2019年1月—2021年4月分離出的不同樣本來(lái)源的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株。樣本來(lái)源于痰液、尿液、腦脊髓、傷口膿液等標(biāo)本。參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行小柴胡湯的藥物配制。按照小柴胡湯藥加水煎煮2次，每次1.5 h, 濾液濃縮; 半夏、生姜用75%乙醇浸泡24 h, 收集提取液，回收乙醇，與上述濃縮液合并，濃縮至60 ℃下相對(duì)密度為1.08～1.10的藥液，噴霧干燥，制成干浸膏粉，備用。注射用亞胺培南西司他丁(上海輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20067765)。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)梅里埃); 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司); 半自動(dòng)多點(diǎn)接種儀(日本株式會(huì)社); 全功能微孔板檢測(cè)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司); 德國(guó)Eppendorf公司PCR擴(kuò)增儀。

1.3 CRAB菌株鑒定和菌懸液的配置

將采集的樣本接種于麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離和培養(yǎng)，根據(jù)菌落具體形態(tài)選擇疑似鮑曼不動(dòng)桿菌的菌落進(jìn)行初步分離，接種于鮑曼不動(dòng)桿菌顯色培養(yǎng)皿, 35 ℃下恒溫孵育24 h。采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定。所有操作嚴(yán)格遵循使用說(shuō)明書，且同一患者多次送檢標(biāo)本檢出同一菌株按1株計(jì)算。將鑒定出的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行耐藥檢驗(yàn)，最終獲得60株非重復(fù)CRAB，接種至菌種保存管中，置于超低溫冰箱中保存。

將凍存CRAB菌株復(fù)蘇3代后，挑選4～5個(gè)菌落，接種于滅菌MHB肉湯中, 37 ℃ 培養(yǎng)箱增菌6 h, 此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌液采用比濁儀調(diào)整濁度至0.5麥?zhǔn)蠞舛群?，再以MHB肉湯稀釋，最終將菌懸液濃度調(diào)整為1×106CFU/mL備用。

1.4 抗菌藥物制備

A組藥物為小柴胡湯中藥提取物，最終稀釋濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10個(gè)濃度。B組藥物為亞胺培南西司他丁，最終濃度為256.00、128.00、64.00、32.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL, 共10個(gè)濃度，備用。

1.5 微量棋盤稀釋法

依據(jù)96孔板棋盤法將配制好的不同濃度的小柴胡湯(A組藥)與亞胺培南西司他丁抗菌藥物(B組藥)兩兩組合，第1列加入A組藥，最后一排加入B組藥，藥物濃度由低到高，用來(lái)測(cè)定單藥最低抑菌濃度(MIC)值; 將制備好的CRAB菌液加入96孔平板的1～11列中。最后一排加入質(zhì)控菌，分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(只加細(xì)菌，無(wú)藥物)和陰性對(duì)照(只加肉湯，無(wú)細(xì)菌)。挑選適量菌落于肉湯中稀釋，使最終每個(gè)孔內(nèi)菌液濃度為5×105CFU/mL, 震蕩后放入37 ℃孵育箱中培養(yǎng)20 h, 觀察結(jié)果。

1.6 聯(lián)合用藥的藥效評(píng)估

記錄單獨(dú)應(yīng)用2種藥物的MICA和MICB, 并記錄96孔板中聯(lián)合區(qū)域中最佳組合效應(yīng)時(shí)2種藥物各自的MIC值，并計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)。FIC=A組藥聯(lián)合時(shí)MIC值/A組藥單用時(shí)MIC值+B組藥聯(lián)合時(shí)MIC值/B組藥單用時(shí)MIC值。當(dāng)FIC≤0.5時(shí)，即2種抗菌藥物為協(xié)同作用; 當(dāng)FIC>0.5～1.0時(shí)，即2種抗菌藥為相加作用; 當(dāng)FIC>1.0～2.0時(shí)，即2種抗菌藥為無(wú)關(guān)作用; 當(dāng)FIC>2.0時(shí)，即2種抗菌藥物為拮抗作用。

1.7 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨(dú)作用及聯(lián)合作用后生物膜抑制實(shí)驗(yàn)[8]

將小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯(lián)合效果為協(xié)同作用的CRAB接種于MHB培養(yǎng)基中，并接種質(zhì)控菌株，在37 ℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)20 h, 采用比濁儀將菌液濃度調(diào)整為1.0×106CFU/mL, 加入無(wú)菌96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，采用MHB培養(yǎng)基分別將小柴胡湯稀釋成1/4、1/16的MIC系列濃度，將亞胺培南西司他丁稀釋成1/4 MIC、1/16 MIC等系列濃度。以棋盤法將不同濃度的小柴胡湯和亞胺培南西司他丁進(jìn)行兩兩組合, 37 ℃培養(yǎng)24 h, 每株菌株設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，使用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行測(cè)定，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm下吸光度，采用A570代表生物被膜生物量, A570越高表示生物膜越強(qiáng)。

1.8 細(xì)菌DNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)耐藥基因轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒(購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司)操作步驟提取細(xì)菌DNA, 采用50 μL常規(guī)反應(yīng)體系。設(shè)置PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃, 5 min預(yù)變性; 95 ℃變性10 s, 60 ℃退火35 s, 65 ℃延伸30 s, 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán); 最后72 ℃下繼續(xù)延伸10 min。引物序列如下,adeJ: 上游序列為5′-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3′, 下游序列為5′-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3′;CarO: 上游序列為5′-GACAACTACAGCTTTACTGCT-3′, 下游序列為5′-ACACCAACTTTACCAACTGG-3′; 內(nèi)參基因選擇16S rRNA: 上游序列為5′-CCTACCAAGGCGACGATCTGT-3′, 下游序列為5′-AACGCTCGCACCCTCTGTATT-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同藥物對(duì)CRAB的MIC比較

小柴胡湯單獨(dú)用藥對(duì)CRAB生長(zhǎng)有一定的抑制作用, MIC為32 μg/mL, 而亞胺培南西司他丁對(duì)CRAB的MIC為16 μg/mL, 見表1。

表1 小柴胡湯和亞胺培南西司他丁藥物對(duì)CRAB的MIC比較

2.2 小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁用藥的抑菌情況

小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用于CRAB, 小柴胡湯濃度分別為8.00、4.00 μg/mL而亞胺培南西司他丁濃度分別2.00、1.00 μg/mL時(shí)，可抑制 CRAB的生長(zhǎng)。不動(dòng)桿菌藥敏FIC=4/32+2/16=0.25, FIC≤0.5, 提示2種藥物有協(xié)同作用，見表2。

表2 小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁用藥的抑菌情況

2.3 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨(dú)作用于CRAB后對(duì)生物膜形成能力的影響

1/16 MIC、1/4 MIC的小柴胡湯單獨(dú)作用于CRAB的吸光度與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.611、2.812,P>0.05); 1/16 MIC、1/4 MIC的亞胺培南西司他丁單獨(dú)作用于CRAB的吸光度與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.777、2.717,P>0.05)。見表3。

表3 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨(dú)作用于CRAB對(duì)生物膜形成能力的影響

2.4 小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用對(duì)CRAB生物膜形成能力的影響

與單獨(dú)應(yīng)用1/16 MIC亞胺培南西司他丁比較，加入1/16、1/4或1 MIC小柴胡湯聯(lián)合1/16 MIC亞胺培南西司他丁后的A570值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.513、10.515、19.802,P<0.05)。與單獨(dú)應(yīng)用1/16 MIC小柴胡湯比較，加入1/16、1/4或1 MIC亞胺培南西司他丁聯(lián)合1/16 MIC小柴胡湯后的A570值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.109、5.657、15.461,P<0.05)。見表4。

表4 小柴胡湯與亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用于CRAB的A570值比較

2.5 小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥對(duì)CRAB外排泵基因adeJ、CarO轉(zhuǎn)錄水平的影響

采用RT-PCR檢測(cè)小柴胡湯、亞胺培南西司他丁單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥對(duì)CRAB外排泵基因adeJ、CarO轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果顯示，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，亞胺培南西司他丁組中adeJ和CarO呈低表達(dá)，聯(lián)合組adeJ和CarO呈高表達(dá)。小柴胡湯與生長(zhǎng)對(duì)照組adeJ、CarO相對(duì)表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 其他各組adeJ、CarO兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A: 各組adeJ基因相對(duì)表達(dá)水平比較; B: 各組CarO基因相對(duì)表達(dá)水平比較。兩者比較, *P<0.05。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，小柴胡湯單獨(dú)用藥對(duì)CRAB有一定的抑制作用, MIC為32 μg/mL; 亞胺培南西司他丁對(duì)CRAB的MIC為16 μg/mL; 小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合作用于CRAB可發(fā)揮協(xié)同作用。亞胺培南西司他丁是碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)及耐受性良好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌及厭氧菌的治療，亦是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的有效藥物[9-10]。中藥作為新的抗菌劑來(lái)源，與常規(guī)抗生素聯(lián)合使用可以彌補(bǔ)常規(guī)抗生素治療的缺陷，提高抗生素的治療效果。小柴胡湯主要用于治療少陽(yáng)病寒熱往來(lái)、胸脅苦滿、不欲飲食、心煩喜嘔、口苦、咽干、目眩等癥狀，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[11-12]。方中柴胡味苦微寒，可疏解少陽(yáng); 黃芩苦寒，氣味較重，可清泄邪熱; 半夏、生姜調(diào)和胃氣，可降逆止嘔; 人參、炙甘草、大棗益氣和中，可扶正祛邪[13-14]。全方攻補(bǔ)兼施，升降協(xié)調(diào)，宣通內(nèi)外，為和解良方。藥理研究[15]證實(shí)，小柴胡湯具有保護(hù)肝損傷、抗胃潰瘍、抗幽門螺桿菌、抗抑郁、抗菌和抗炎等作用。本研究顯示，小柴胡湯單獨(dú)使用對(duì)CRAB有一定的抑菌作用，而小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合使用可發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)抗生素的抑菌效果。

本研究進(jìn)一步探討小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合使用發(fā)揮抗菌效果的機(jī)制，結(jié)果表明，小柴胡湯和亞胺培南西司他丁可進(jìn)一步激活adeJ、CarO基因，考慮小柴胡湯和亞胺培南西司他丁聯(lián)合使用后可降低亞胺培南西司他丁單獨(dú)用藥對(duì)CRAB的MIC, 可能是外膜孔蛋白基因CarO的激活發(fā)揮了主要作用，使小柴胡湯有效成分進(jìn)入菌體內(nèi)，從而聯(lián)合亞胺培南西司他丁共同發(fā)揮抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。外排泵可以輸送多種化合物，與細(xì)菌多重耐藥性有關(guān)。既往研究[16]表明,CarO表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的亞胺培南量減少，達(dá)不到抑菌所需對(duì)的濃度，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。以上研究均表明, 2種藥物聯(lián)用激活了部分外排泵基因表達(dá)，對(duì)細(xì)菌具有一定抑制作用。

生物膜的生成使細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物具有更強(qiáng)的抵抗力，增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性[17]。本研究針對(duì)形成生物膜的CRAB進(jìn)行生物膜抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁具有抗菌協(xié)同作用，有抑制和清除CRAB生物膜的作用。小柴胡湯或亞胺培南西司他丁單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)生物膜的抑制作用無(wú)顯著差異，可能是生物膜阻礙了藥物進(jìn)入，導(dǎo)致殺菌作用被抑制。細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中黏附于生物或非生物表面，由細(xì)菌自身分泌的胞外多糖基質(zhì)組成的細(xì)菌群體，是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的極好環(huán)境，可獲得耐藥基因[18-19]。臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌幾乎都有形成生物膜的能力, 48 h內(nèi)就能夠形成成熟的生物膜，且生物膜形成后需要極高的藥物濃度才可清除，而體內(nèi)的藥物濃度通常達(dá)不到清除所需的濃度，且高藥物濃度將會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且使耐藥基因水平轉(zhuǎn)移并演變出生物膜形成能力高的耐藥菌株。因此，臨床醫(yī)師在治療此類患者時(shí)應(yīng)改變治療方針，除了將治療重點(diǎn)放在預(yù)防及診斷上外，也需要及時(shí)治療急性感染，盡量杜絕慢性感染的出現(xiàn)以避免生物膜的形成。

綜上所述，小柴胡湯聯(lián)用亞胺培南西司他丁表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用，在清除生物膜方面，小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁雖然可提高生物膜清除率，但其不良反應(yīng)很嚴(yán)重。小柴胡湯聯(lián)合亞胺培南西司他丁可對(duì)CRAB發(fā)揮抑菌作用，其機(jī)制可能是通過激活部分外排泵基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。