miR-320通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕大鼠燒傷后腸道黏膜損傷

溫海玲 楊景哲 孟祥熙 張祥云

1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院南院區(qū)燒傷整形科（河北承德 067000）；2河北省軍區(qū)承德離職干部休養(yǎng)所（河北承德 067000）

燒傷后腸道損傷引起的生理屏障損傷是導致患者死亡的重要因素之一［1］。嚴重燒傷，腸道微血管通透性增加，腸細胞壞死、細胞凋亡和腸黏膜屏障功能受損，導致腸道細菌和毒素移位，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征［2］。最近的研究表明，腸道炎癥是燒傷后腸道屏障破壞的主要原因［3］。然而，腸道微生態(tài)是一個與宿主共生的復雜生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。腸道微生態(tài)功能障礙介導的腸道屏障破壞的具體機制涉及多種因素。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是哺乳動物模式識別受體家族的成員，被認為是將細胞外抗原識別信息傳遞給細胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白［4］。研究表明［5］，TLR4 在燒傷期間的炎癥啟動和器官損傷中起著至關(guān)重要的作用。通過髓系分化初級反應(yīng)基因88（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88）依賴性通路，TLR4 可以介導核因子（NF）-κB的活化，進而誘導包括腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-6 在內(nèi)的炎性細胞因子的表達和釋放，導致炎癥正反饋的惡性循環(huán)［5］。但是TLR4 只能通過與其特異性配體結(jié)合才能介導下游信號轉(zhuǎn)導［6］。MicroRNA（miRNA）是短的非編碼RNA 序列，在各種生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。燒傷、疾病和其他一些因素可能會改變miRNA 的表達，從而對腸道穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生負面影響［8］。有證據(jù)表明miR-320 參與了多種病理過程，包括調(diào)節(jié)各種細胞和器官的炎癥過程，并且與細胞增殖、凋亡有關(guān)［9］。此外，最新證據(jù)表明，上調(diào)miR-320 表達減少燒傷后氧化應(yīng)激和腸細胞凋亡［10］。表明miR-320 可能在燒傷誘導的腸道損傷中具有保護作用，但是具體作用機制仍有待進一步研究。因此，本研究通過建立大鼠燒傷模型，探討miR-320 的腸道保護機制是否與TLR4/NF-κB 信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley 大鼠（240 ～260 g）購自北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號SCXK（京）2019-0008）。大鼠被關(guān)在籠子里，在特定的無病原體條件下，允許隨意獲取食物和水，并保持12 h 的暗/光周期（室溫20～24 ℃，相對濕度40%～70%）。這些動物是分開飼養(yǎng)的，隨機在籠子里飼養(yǎng)4 ～6 只動物。本研究經(jīng)承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 燒傷模型建立和分組處理 在燒傷模型建立前24 h，將80 g/L 硫化鈉應(yīng)用于大鼠脫毛背表面。實驗前12 h 禁食物和水。通過腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉動物。將大鼠放置在預制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時保護剩余皮膚，根據(jù)Walker-Mason 燒傷模型［11］，將大鼠裸露的皮膚沉浸在沸水中（100 ℃水浴，背部15 s）造成20%TBSAⅢ°燙傷（下文簡稱燒傷），燒傷后大鼠立即干燥。假手術(shù)組采用溫水（37 ℃水浴，背部15 s）行背部浸泡。SD 大鼠隨機分為4組（n=12）：假手術(shù)（Sham）組、假手術(shù)+miR-320 組、燒傷（Scald）組和燒傷+miR-320組。燒傷組和燒傷+miR-320 組建立燒傷模型，并且燒傷+miR-320 組在燒傷模型建立前1 周通過尾靜脈注射腺相關(guān)病毒（AAV）-miR-320（山東維真生物科技有限公司），連續(xù)3 d，每天注射5 μL。此外，假手術(shù)+miR-320 組在相同時間注射AAV-miR-320。各組于燒傷后24 h 隨機處死6 只動物。麻醉動物后，沿著腹部中線切開腹壁，暴露并分離腹主動脈，并進行腹主動脈穿刺。抽取10 mL 動脈血，將動物處死。切除回腸末端組織，用生理鹽水沖洗并分成兩部分。其中一部分在液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移到冰箱中-80 ℃保存。另一部分儲存在4%多聚甲醛中。各組其余6只小鼠用于體內(nèi)FITC-葡聚糖測定。

1.3 組織學分析 回腸末端組織在4%多聚甲醛中浸泡一夜，轉(zhuǎn)移到pH 7.4 的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并以4 μm 的厚度切片。隨后，使用蘇木精和伊紅（H&E）對切片進行染色，并使用光學顯微鏡進行觀察。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 將獲取血樣在4 ℃下以3 000×g離心15 min。收集從樣品中分離的血清，并使用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6 和DAO的濃度。

1.5 體內(nèi)FITC-葡聚糖測定 參照文獻方法［12］測定FITC-葡聚糖，用于評估腸道通透性。大鼠禁食3 h，然后以40 mg/100 g 的劑量灌胃FITC-葡聚糖溶液。4 h 后，通過腹主動脈穿刺采集血樣，并在4 ℃下以3 000 ×g離心10 min 分離血清。使用熒光酶標儀測量FD-40 的血清吸光度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.6 RNA 提取和RT-qPCR 分析 使用總RNA 提取試劑盒（北京Solarbio 公司）從腸組織中提取總RNA。然后使用iScript cDNA 合成試劑盒（美國Bio-Rad 公司）對RNA 樣本進行反轉(zhuǎn)錄，并在CFX96實時系統(tǒng)（Bio-Rad）上使用SYBR Green Supermix（Bio-Rad）進行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTqPCR）擴增。miR-320 的定量使用針對miRNA 設(shè)計的Bulge-loop miRNA RT-qPCR 引物（廣州RiboBio公司）進行。U6 用于使miR-320 水平正?；Ｋ褂玫囊镄蛄腥缦拢簃iR-320 正向：5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGGG-3′，反向：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6 正向：5′-GAAGCGCGGCCACGAG-3′，反向：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。

1.7 細胞培養(yǎng)和處理 人結(jié)腸上皮細胞株NCM460購自武漢普諾賽生命科技有限公司。細胞接種在含有10%胎牛血清（FBS）（美國Invitrogen 公司）、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。當細胞達到70% ～80%匯合時，將細胞分為：對照組（Con）、Con+miR-320 組、LPS 組和LPS+miR-320 組。miR-320 模擬物（miR-320）和對照模擬物（miR-NC）均購自廣州Ribo-Bio 公司。使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen 公司）將miRNC 轉(zhuǎn)染至Con 組和Con+miR-320 組細胞，將miR-320 轉(zhuǎn)染至LPS 組和LPS+miR-320 組細胞。48 h后收獲轉(zhuǎn)染細胞，LPS 組和LPS+miR-320 組加入50 μg/mL LPS（美國Sigma 公司）處理24 h。Con 組和Con+miR-320 組使用載體處理24 h。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA 裂解緩沖液（上海Beyotime 公司）在冰上從回腸組織或細胞中分離總蛋白。收集上清液，并在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min后，使用BCA分析試劑盒（上海Beyotime公司）檢測蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)通過10% SDSPAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，將膜用PBS 洗滌兩次，隨后與針對ZO-1（1∶500；美國Invitrogen 公司），Claudin 1（1∶500；英國Abcam 公司），TLR4、MyD88、NF-κB p-p65、NF-κB p65（1∶800；美國CST 公司）和GAPDH（1∶10 000；Abcam）在4 ℃孵育過夜。將膜用Tris 緩沖液-吐溫緩沖液洗滌3 次，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000；Abcam）在室溫下孵育1 h。使用增強型化學發(fā)光試劑（美國PerkinElmer 公司）顯示信號。使用Image J 軟件計算條帶強度，并將其歸一化為GAPDH 的條帶強度。

1.9 熒光素酶報告基因檢測 TLR4 的pGL3 熒光素酶報告質(zhì)粒由上海Genomeditech 公司設(shè)計。使用Lipofectamine 3000 試劑將報告質(zhì)粒或載體對照和miR-320 模擬物或miR-NC 共轉(zhuǎn)染到NCM460細胞中。48 h 后，使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)（美國Promega 公司）檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，并使用SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)分析。通過方差分析（ANOVA）或t檢驗評估差異的顯著性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷誘導的腸屏障功能障礙期間miR-320 表達降低 假手術(shù)組腸黏膜絨毛在燒傷后24 h 致密、高聳、完整，無炎性細胞浸潤（圖1A）。與假手術(shù)組相比，燒傷組腸黏膜絨毛水腫、變短、變寬，腸黏膜明顯受損，有大量炎性細胞浸潤，并且燒傷組大鼠血清中DAO 和FITC 葡聚糖表達顯著增加（P＜0.05）（圖1B-C），表明燒傷大鼠腸道通透性增加。此外，燒傷組大鼠腸道組織中miR-320 的表達較假手術(shù)組顯著降低（P＜0.05，圖1D）。

圖1 燒傷誘導的腸屏障功能障礙期間miR-320 表達降低Fig.1 Decreased miR-320 expression during burn-induced intestinal barrier dysfunction

2.2 miR-320 上調(diào)減弱炎癥反應(yīng)并改善燒傷大鼠的腸道屏障功能 大鼠通過尾靜脈連續(xù)三天注射miR-320 模擬物，誘導腸組織中miR-320 表達顯著增加（P＜0.05，圖2A）。ELISA 測量顯示上調(diào)miR-320 顯著 降 低了TNF-α 和IL-6的血清濃度（P＜0.05，圖2B、C）。此外，燒傷誘導的血清DAO和FITC-葡聚糖以及萎縮性腸黏膜的增加被miR-320 模擬物部分改善（P＜0.05，圖2D、F）。通過用miR-320 模擬物處理，腸道組織中Occludin 和ZO-1的水平也升高（P＜0.05，圖2G）。

圖2 miR-320 上調(diào)減弱炎癥反應(yīng)并改善燒傷大鼠的腸道屏障功能Fig.2 Up-regulation of miR-320 attenuates inflammatory response and improves intestinal barrier function in burned rats

2.3 miR-320介導的保護作用涉及TLR4/NF-κB信號通路 與假手術(shù)組相比，燒傷組中TLR4、MyD88蛋白的表達和p-NF-κB（p-p65）磷酸化均顯著升高（P＜0.05）。與燒傷組相比，燒傷+miR-320 組中TLR4、MyD88 蛋白的表達和p-NF-κB（p-p65）磷酸化均顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 miR-320 抑制燒傷大鼠腸道中TLR4/NF-κB 信號通路Fig.3 miR-320 inhibits the TLR4/NF-κB signaling pathway in the gut of burn rats

2.4 miR-320 體外抑制腸上皮細胞TLR4/NF-κB通路的活性 研究使用TargetScan 證實了TLR4 是miR-320 的潛在靶基因（圖4A）。細胞熒光素酶活性測定結(jié)果表明，在pGL3-TLR4 3′UTR-WT 載體存在的情況下，用miR-320 模擬物轉(zhuǎn)染的細胞中熒光素酶活性降低（P＜0.05，圖4B）。此外，LPS 處理的NCM460 細胞中miR-320 表達顯著降低（P＜0.05），TLR4、MyD88 蛋白的表達和p-NF-κB（p-p65）磷酸化均顯著升高（P＜0.05，圖4C、D）。miR-320上調(diào)逆轉(zhuǎn)了LPS 誘導的TLR4/NF-κB 通路激活（P＜0.05），并且減少了NCM460 細胞培養(yǎng)基中TNF-α 和IL-6的濃度（P＜0.05，圖4E、F）。

圖4 miR-320 體外抑制腸上皮細胞TLR4/NF-κB 通路的活性Fig.4 miR-320 inhibits the activity of TLR4/NF-κB pathway in intestinal epithelial cells in vitro

3 討論

燒傷會改變腸道結(jié)構(gòu)、功能并破壞腸黏膜屏障，從而導致腸道細菌移位和嚴重的燒傷感染［1］。因此，保護腸道結(jié)構(gòu)的完整性，促進燒傷后腸黏膜的恢復，具有重要的臨床意義。本研究中，HE 染色觀察到燒傷模型大鼠腸絨毛紊亂，腸細胞變性壞死，表明燒傷大鼠腸黏膜受損。先前研究表明，miR-320 與腸道免疫密切相關(guān)，在腸道損傷中起著核心作用［13］。本研究改變了腸道m(xù)iR-320的表達并建立了燒傷大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-320 會降低腸道炎癥水平并減輕腸道屏障的破壞，其保護機制與抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路激活相關(guān)。

越來越多的研究認為miRNA 在許多免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用［14］。最近的一項研究［13］報告，miR-320 通過與眾多靶標結(jié)合來調(diào)節(jié)主要免疫細胞類型，從而調(diào)節(jié)微環(huán)境。腸道是一個巨大的免疫器官，是一個完整而穩(wěn)定的生物網(wǎng)絡(luò)［15］。腸道微環(huán)境至關(guān)重要，腸道菌群越來越被認為是腸道微環(huán)境的重要組成部分；許多研究都報道了疾病中腸道菌群的變化。既往研究報道，miRNAs 參與病原菌感染中免疫功能和炎癥的調(diào)節(jié)［16］。LIU等［17］據(jù)報道，大腸桿菌和具核梭桿菌的生長受合成的miRNA 模擬物調(diào)節(jié)，其滲透細菌并因此影響細菌基因調(diào)控。miR-320 具有復雜的生物學功能和獨特的表達譜，在各種生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用［5］。它是一種被廣泛研究的miRNA，與免疫和炎癥密切相關(guān)。既往研究［18］證實，miR-320 在炎癥性腸病患者的炎癥組織中低表達。此外，有研究［19］發(fā)現(xiàn)miR-320 在實驗性結(jié)腸炎的過程增強腸道屏障功能。本研究得出了相同的結(jié)論。此外，AAV9 可以介導腸道中的靶向基因轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)miR-320 在腸道中的表達［20］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320 過表達減輕了腸道屏障的破壞與炎癥水平。因此，進一步證明了miR-320 可能在保護燒傷介導的腸道破壞中起重要作用。

本研究觀察到燒傷誘導后，大鼠表現(xiàn)出嚴重的腸道炎癥，這與之前的研究結(jié)果一致［3，10］。同時，燒傷誘導腸道TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的明顯激活。miR-320 干預改善了腸道炎癥，并顯著抑制了TLR4/MyD88/NF-κB 的激活。TLR4/MyD88/NF-κB 通路被普遍認為在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［21］。在健康的成年哺乳動物中，腸道上皮中的TLR4 表達水平通常非常低甚至可以忽略不計，從而限制了針對胃腸道微生物群的過度炎癥反應(yīng)［22］；而在各種病理情況下腸道TLR4 表達顯著增加，例如缺血/再灌注、內(nèi)毒素血癥、潰瘍性結(jié)腸炎等［23］。WEN 等［24］發(fā)現(xiàn)在嚴重燒傷大鼠腸道的黏膜中，TLR4和NF-κB蛋白水平高度上調(diào)。相比之下，本研究顯示燒傷后大鼠腸道組織中TLR4 蛋白表達的明顯上調(diào)。另一方面，TLR4/NF-κB 激活也被證明可以下調(diào)TJP 表達并增加腸道通透性。GUO 等［5］觀察到燒傷大鼠回腸遠端TLR4/NF-κB 激活，伴隨明顯的腸道屏障破壞，表現(xiàn)為血漿DAO 和內(nèi)毒素水平升高，以及ZO-1 和occludin 下調(diào)。本研究驗證了上述結(jié)果，并在體外觀察到miR-320 可抑制LPS 誘導的腸上皮細胞TLR4/NF-κB 信號通路激活，表明miR-320 的腸道保護機制與抑制TLR4/NF-κB 通路有關(guān)。

總之，本研究揭示了燒傷誘導的腸屏障功能障礙中miR-320 水平降低。miR-320 的上調(diào)通過抑制TLR4/MyD88//NF-κB 信號通路來減少炎癥反應(yīng)并改善腸道屏障功能。因此，miR-320 有望成為治療燒傷誘導的腸道屏障功能障礙的潛在新靶點。