lncRNA PVT1靶向調(diào)控miR-625-5p對高糖誘導(dǎo)心肌細胞損傷的影響及其機制

黃 嵐，張洪波，莊 紅

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并發(fā)癥，這也是糖尿病患者病死率高的原因之一，對患者生命健康帶來嚴(yán)重威脅[1]。心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病的主要發(fā)病機制[2]，但其具體機制還未闡述清楚。長鏈非編碼RNA(lncRNA)與心肌細胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過程密切相關(guān)，可加速心肌細胞凋亡，引起一系列病變發(fā)生，包括糖尿病心肌病[3-4]。漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1(PVT1)是一種在鼠漿細胞瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)的致癌lncRNA，位于染色體8q24區(qū)域，可參與多種疾病的發(fā)展[5]。有研究表明，高糖誘導(dǎo)的心肌細胞中PVT1呈高表達，下調(diào)PVT1可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，起到保護心肌細胞的作用[6]。在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-625-5p是PVT1靶基因之一，miR-625-5p在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細胞中表達下調(diào)，并通過靶向調(diào)控STAT3/CaMKII減輕心肌肥大[7]。但是關(guān)于miR-625-5p對高糖誘導(dǎo)心肌細胞損傷的研究少見報道。鑒于此，本研究主要探討lncRNA PVT1靶向調(diào)控miR-625-5p對高糖誘導(dǎo)心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 心肌H9c2細胞購自中國科學(xué)院上海細胞中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖購自美國Sigma公司；si-NC、si-PVT1、miR-NC、miR-625-5p、anti-miR-NC、anti-miR-625-5p及相關(guān)引物均購自上海吉瑪生物科技有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Cleaved-caspase3抗體、Bax抗體、GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司；RIPA試劑、BCA試劑盒、ECL試劑、雙熒光素酶實驗檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌H9c2細胞，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。將對數(shù)生長期H9c2細胞接種于96孔板中，當(dāng)細胞融合度為70%時，棄去培養(yǎng)基，更換為不含胎牛血清培養(yǎng)基，用5.5、30.0 mmol/L葡萄糖干預(yù)48 h，分別記為NG組、HG組；按照脂質(zhì)體法將si-NC、si-PVT1、miR-NC、miR-625-5p、si-PVT1+anti-miR-NC、si-PVT1+anti-miR-625-5p轉(zhuǎn)染H9c2細胞，然后用30.0 mmol/L葡萄糖干預(yù)48 h，分別記為HG+si-NC組、HG+si-PVT1組、HG+miR-NC組、HG+miR-625-5p組、HG+si-PVT1+anti-miR-NC組、HG+si-PVT1+anti-miR-625-5p組。

1.3qRT-PCR檢測PVT1、miR-625-5p表達量 各組H9c2細胞使用TRIzol試劑盒提取總RNA，檢測其濃度和純度后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，并配置20 μl反應(yīng)體系進行擴增。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法計算PVT1、miR-625-5p表達量。PVT1正向引物：5'-CCTGGTGAAGCATCTGATGCACG-3'，反向引物：5'-GCCAGGCTTTGTGGCACACGC-3'；GAPDH正向引物：5'-CGAGAATGGGAAGCTTGTC-3'，反向引物：5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'。miR-625-5p正向引物：5'-ACTCCAGCTGGGAGGGGAAAGTTCTATAG-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 使用PBS沖洗各組H9c2細胞，結(jié)束后加400 μl緩沖液制備成細胞懸液，先后依次加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI試劑，混勻避光反應(yīng)30 min，加100 μl緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5Western blot檢測Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達 各組H9c2細胞加入RIPA試劑，置于冰上30 min，離心10 min取上清液，BCA法測定蛋白濃度，將上樣緩沖液加熱變性5 min，行SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)膜后使用脫脂奶粉封閉90 min，加入一抗Cleaved-caspase3(1∶800)、Bax(1∶800)、GAPDH(1∶1000)稀釋液4 ℃條件下孵育過夜，次日加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)稀釋液，室溫孵育90 min，將ECL試劑滴在膜內(nèi)，顯色、曝光。應(yīng)用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平 各組H9c2細胞離心結(jié)束后，取上清液按照試劑盒說明書操作步驟，分別檢測上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平。

1.7雙熒光素酶報告實驗驗證PVT1與miR-625-5p的靶向關(guān)系 通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示PVT1與miR-625-5p存在結(jié)合位點，然后擴增含miR-625-5p結(jié)合位點的PVT1序列，插入pMIR-REPORT載體，分別構(gòu)建野生型、突變型PVT1序列，即WT-PVT1、MUT-PVT1。將對數(shù)期H9c2細胞接種24孔板內(nèi)，待融合至70%時，將WT-PVT1、MUT-PVT1分別與miR-NC或miR-625-5p共轉(zhuǎn)染至H9c2細胞，48 h后收集細胞按照雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒檢測其熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1PVT1在高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞中的表達 NG組PVT1表達量為1.00±0.09，HG組為4.11±0.37，HG+si-NC組為4.14±0.40，HG+si-PVT1組為2.37±0.21。與NG組比較，HG組PVT1表達量顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組PVT1表達量顯著降低(P<0.05)。

2.2干擾PVT1對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞凋亡的影響 與NG組比較，HG組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達及凋亡率顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達及凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1和2。

表1 干擾PVT1對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達及凋亡率的影響

2.3干擾PVT1對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞炎癥反應(yīng)的影響 與NG組比較，HG組TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 干擾PVT1對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平的影響

2.4PVT1靶向調(diào)控miR-625-5p分析 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，PVT1與miR-625-5p存在互補的結(jié)合位點。見圖3。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-625-5p組MUT-PVT1熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，WT-PVT1熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。NG組miR-625-5p表達量為1.01±0.07，HG組為0.32±0.05，HG+si-NC組為0.33±0.04，HG+si-PVT1組為0.74±0.08。與NG組比較，HG組miR-625-5p表達量顯著降低(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-PVT1組miR-625-5p表達量顯著升高(P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.5過表達miR-625-5p對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞損傷的影響 與HG+miR-NC組比較，HG+miR-625-5p組miR-625-5p表達量顯著升高，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表4和5。

表4 過表達miR-625-5p對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達及凋亡率的影響

表5 過表達miR-625-5p對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平的影響

2.6抑制miR-625-5p對干擾PVT1后高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞損傷的影響 與HG+si-PVT1+anti-miR-NC組比較，HG+si-PVT1+anti-miR-625-5p組miR-625-5p表達量顯著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表6和7。

表7 抑制miR-625-5p對干擾PVT1后高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平的影響

3 討論

糖尿病是常見的代謝疾病，且大部分患者伴有心血管疾病，而糖尿病心肌病較為常見[8-9]。長期高血糖可引起心肌細胞糖脂代謝失衡，進一步促進氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，可加重糖尿病心肌病的發(fā)生[10-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)心肌細胞后，其凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平增加，而Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達也明顯上調(diào)，與上述研究結(jié)果相似。

lncRNA在進化上高度保守，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其與糖尿病心肌病發(fā)生密切相關(guān)，其中DCRF、MEG3、HOTAIR等已被證實，并有望成為糖尿病心肌病的潛在治療靶點[14-15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病患者血清TINCR低表達，上調(diào)TINCR可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[16]。有研究結(jié)果顯示，HOTAIR在糖尿病心肌組織和血清中低表達，上調(diào)HOTAIR可通過激活PI3K/Akt信號通路改善糖尿病心肌病進展[17]。高糖誘導(dǎo)心肌細胞后KCNQ1OT1高表達，并可通過調(diào)控miR-181a-5p/PDCD4軸減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[18]。PVT1在心臟毒性、心肌缺血再灌注損傷中高表達，可通過調(diào)控miR-187-3p或miR-214-3p促進疾病發(fā)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞后PVT1表達量增加，干擾PVT1可降低高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平及凋亡率，并下調(diào)Cleaved-caspase3、Bax蛋白表達，提示干擾PVT1能減輕高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞的損傷。

PVT1可通過調(diào)控下游miRNA參與心肌細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程，進而加快疾病發(fā)展[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PVT1與miR-625-5p存在相互結(jié)合的位點，雙熒光素酶報告實驗顯示，過表達miR-625-5p可降低WT-PVT1熒光素酶活性，但對MUT-PVT1熒光素酶活性無影響，再次證明PVT1可靶向調(diào)控miR-625-5p表達。miR-625-5p在多種疾病中差異表達，如脂多糖刺激人支氣管上皮細胞miR-625-5p表達上調(diào)，并通過靶向AKT2減輕脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮細胞炎癥反應(yīng)[23]。有研究顯示，在構(gòu)建體外急性肺損傷模型中miR-625-5p表達上調(diào)，miR-625-5p可通過激活NF-κB信號通路減輕急性肺損傷的肺部炎癥反應(yīng)[24]。但是在小兒哮喘中miR-625-5p低表達，可通過調(diào)控CBL/ESR1表達減輕塵螨誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[25]。先前研究顯示，miR-625-5p在心肌肥大患者中低表達[7]，但是對糖尿病心肌病未知。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞后miR-625-5p表達量降低，干擾PVT1可增加miR-625-5p表達量，提示PVT1靶向負調(diào)控miR-625-5p，且過表達miR-625-5p可抑制高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。進一步研究結(jié)果顯示，抑制miR-625-5p可逆轉(zhuǎn)干擾PVT1對高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，提示PVT1可靶向負調(diào)控miR-625-5p減輕高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞損傷。

綜上所述，干擾PVT1可減輕高糖誘導(dǎo)心肌H9c2細胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，與負調(diào)控miR-625-5p表達有關(guān)。