浚單玉米骨干系抗南方銹病及優(yōu)異結(jié)實(shí)性分子機(jī)理探究

張文成 王良發(fā) 章慧玉 靳海蕾 張志方 李長(zhǎng)建 張守林

（鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 河南 鶴壁 458030）

玉米（Zea may L.）作為世界上最重要的糧食、飼料和能源作物之一，在保障我國(guó)糧食安全、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及緩解能源危機(jī)等方面發(fā)揮著不可替代的作用[1]。近年來(lái)，極端災(zāi)害天氣頻發(fā)，玉米病害及熱害已經(jīng)嚴(yán)重威脅黃淮海地區(qū)玉米生產(chǎn)。

受熱帶氣旋活動(dòng)影響，以前主要在我國(guó)臺(tái)灣、海南、廣東、福建等省發(fā)生的玉米南方銹病，現(xiàn)已成為黃淮海夏玉米區(qū)突發(fā)性、暴發(fā)性、生產(chǎn)危害性極大的病害[2]。2015年和2021年，黃淮海地區(qū)大面積暴發(fā)了玉米南方銹病，產(chǎn)量損失嚴(yán)重，玉米南方銹病在我國(guó)由次要病害上升為主要病害[3]。對(duì)南方銹病抗性QTL和基因的鑒定與定位研究也在不斷地跟進(jìn)。我國(guó)科研工作者利用抗南方銹病玉米自交系材料和感病材料進(jìn)行遺傳分析，定位到多個(gè)玉米抗南方銹病主效基因位點(diǎn)，大多數(shù)位于10號(hào)染色體短臂[4-7]。最近，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)丁俊強(qiáng)教授課題組定位并克隆到一個(gè)玉米抗南方銹病主效基因RppC，并解析了RppC蛋白的抗病機(jī)理[8]。通過(guò)與感病材料Lx9801序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該基因在Lx9801中存在多處變異，其中一個(gè)A堿基的插入導(dǎo)致RppC翻譯提前終止。利用轉(zhuǎn)基因方法驗(yàn)證了RppC的抗病效應(yīng)。對(duì)從我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)分離的577份田間病原菌進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)RppC能識(shí)別83.5%的AvrRppC結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，從而對(duì)當(dāng)前南方銹病病原菌優(yōu)勢(shì)小種產(chǎn)生抗病反應(yīng)，表明RppC是一個(gè)優(yōu)異的抗病基因資源。并針對(duì)抗病材料CML496和感病材料Lx9801在RppC基因序列上的差異，設(shè)計(jì)特異引物用于檢測(cè)RppC基因，若能擴(kuò)增出條帶，則為CML496-RppC類型。

玉米籽粒產(chǎn)量是一復(fù)雜的綜合性狀，直接受穗長(zhǎng)、穗粗、行粒數(shù)、穗行數(shù)、粒長(zhǎng)等影響。然而穗長(zhǎng)、穗粗、行粒數(shù)、穗行數(shù)、粒長(zhǎng)等性狀又受到穗分化時(shí)花序分生組織（Inflorescence Meristem）活性影響[9-10]。玉米行粒數(shù)作為重要的產(chǎn)量構(gòu)成因子之一，增加行粒數(shù)，可使單穗產(chǎn)量增加。迄今為止已鑒定出多個(gè)玉米穗長(zhǎng)相關(guān)的QTL，但僅有少數(shù)基因被克隆，基因KNR6和YIGE1可通過(guò)調(diào)控穗長(zhǎng)、行粒數(shù)來(lái)提高玉米產(chǎn)量[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，基因ZmACO2并不是直接通過(guò)調(diào)控行粒數(shù)來(lái)提高玉米產(chǎn)量，而是通過(guò)提高玉米幼穗頂部雌花育性來(lái)提高玉米產(chǎn)量[14]。基因ZmACO2是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張祖新教授課題組克隆，參與花序發(fā)育進(jìn)程中內(nèi)源乙烯的生物合成。敲除ZmACO2基因，雌花序中內(nèi)源乙烯的合成減少，雌性小花的敗育率下降，結(jié)實(shí)率增加，單穗籽粒數(shù)增加，同時(shí)敲除ZmACO2基因也可使雜交種增產(chǎn)約13.4%。對(duì)單倍型Ye478和單倍型SL17基因序列分析發(fā)現(xiàn)，在基因編碼區(qū)兩單倍型沒(méi)有序列差異，而是啟動(dòng)子區(qū)域4個(gè)SNP和1個(gè)InDel差異與敗育率關(guān)聯(lián)度高。啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致單倍型Ye478的ZmACO2基因表達(dá)少于單倍型SL17，從而引起乙烯及相關(guān)植物激素在兩單倍型中表達(dá)差異，最終導(dǎo)致Ye478行粒數(shù)高于SL17、Ye478穗長(zhǎng)度大于SL17。

鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院在玉米新品種選育過(guò)程中特別注重抗病性和結(jié)實(shí)性優(yōu)異種質(zhì)的選育。鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米種質(zhì)具有優(yōu)良的結(jié)實(shí)性，在此基礎(chǔ)上，近年來(lái)從我國(guó)南方引進(jìn)了一批抗病種質(zhì)材料。利用不同生態(tài)區(qū)域選育父本群和母本群的方法，選育出一批結(jié)實(shí)性好、抗病性強(qiáng)的優(yōu)良玉米自交系，并組配出一批優(yōu)良玉米新品種通過(guò)國(guó)家、省級(jí)試驗(yàn)審定。為了探究鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米種質(zhì)抗病性強(qiáng)、結(jié)實(shí)性好、配合力高的分子機(jī)理，特選用河南農(nóng)業(yè)大學(xué)丁俊強(qiáng)教授課題組報(bào)道的抗南方銹病主效基因RppC特異引物、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張祖新教授課題組報(bào)道的乙烯合成關(guān)鍵酶基因ZmACO2啟動(dòng)子區(qū)特異引物對(duì)鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院骨干系材料進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序分析，找到相應(yīng)的抗南方銹病、高結(jié)實(shí)率材料，便于以后分子標(biāo)記輔助選擇育種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用20份鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自選系、1份蘇艾自交系MD15及鄭58、昌7-2、掖478為供試材料（表1）。

1.2 檢測(cè)引物

參考Ce Deng等[8]發(fā)表的論文，選取表2中特異引物檢測(cè)供試材料抗南方銹病基因RppC和調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動(dòng)子區(qū)。

表2 試驗(yàn)所用引物名稱及序列

1.3 試驗(yàn)方法

2022年6 月，在鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園區(qū)種植玉米試驗(yàn)材料。7片展開(kāi)葉時(shí)采集葉片，采用TPS法提取DNA。利用抗南方銹病基因RppC和調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動(dòng)子區(qū)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取8 μl擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)目的條帶。將有擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)PCR反應(yīng)液送生工生物公司測(cè)序。

運(yùn)用Dnaman軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

抗南方銹病主效基因RppC擴(kuò)增見(jiàn)圖1，圖1中編 號(hào)1～24對(duì) 應(yīng) 表1中1～24號(hào) 自 交 系。利 用CML496-allele-speicific-F/R引物對(duì)24個(gè)玉米自交系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中浚5036、浚6366、浚6368、浚6313、浚50X、浚58、浚208A、浚3665、浚M9、浚351、浚JC125、MD15均擴(kuò)增出588 bp條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，12個(gè)自交系材料擴(kuò)增序列與參考CML496-RppC基因特異序列完全一致（圖2）。CML496-allele-speicific-F/R特異擴(kuò)增抗南方銹病主效基因CML496-RppC原理見(jiàn)圖2。在所選取的全部24個(gè)優(yōu)良自交系中，有50.0%的材料具有RppC優(yōu)異抗南方銹病基因資源；在所選取鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院20個(gè)骨干材料中，有55.0%的自交系含有RppC抗性基因。

表1 供試材料及所屬類群

調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動(dòng)子區(qū)PCR結(jié)果見(jiàn)圖3，除浚SN12E、浚96、浚313、MD15、鄭58外，其他19個(gè)材料均擴(kuò)增出1 300 bp左右的目的條帶。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所選取19個(gè)自交系的ZmACO2基因上游啟動(dòng)子區(qū)分為2種基因型，以掖478、浚M98為代表的見(jiàn)圖4。與掖478序列相同的有浚5036、浚6366、浚6368、浚9058、浚6313、浚50X、浚3138、浚58、浚208A、浚3665、浚728、浚M9、浚G6Y6-2；與浚M98序列相同的有浚97、浚351、浚JC125、昌7-2。

3 討論與結(jié)論

玉米南方銹病由多堆柄銹菌（Puccinia polysora Underw.）引起的真菌性病害，近年來(lái)，已成為黃淮海地區(qū)主要病害之一，導(dǎo)致部分地區(qū)玉米大幅減產(chǎn)[13]。尤其是2021年，黃淮海地區(qū)鄭單958較早感南方銹病，產(chǎn)量銳減。通過(guò)考察各試驗(yàn)點(diǎn)參試品種，大多數(shù)品種均不同程度遭受南方銹病侵染，只有少數(shù)品種表現(xiàn)出較好的抗性。說(shuō)明黃淮海地區(qū)育種家培育的抗南方銹病種質(zhì)資源較少，開(kāi)展抗南方銹病優(yōu)異種質(zhì)創(chuàng)制研究迫在眉睫。選育抗南方銹病種質(zhì)是最經(jīng)濟(jì)、安全的應(yīng)對(duì)方式。2003年，?？h農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（2009年更名為鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院）承擔(dān)國(guó)家黃淮海夏玉米區(qū)域試驗(yàn)，國(guó)外的M118和M119兩個(gè)品種在試驗(yàn)中株型比較緊湊，與國(guó)內(nèi)參試品種株型差異較大?？？h農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所在2004年夏天對(duì)2個(gè)雜交種選優(yōu)株進(jìn)行套袋自交，然后通過(guò)南繁北育、異地逆境選擇，從M119中選育出優(yōu)良自交系浚M9。用浚M9已經(jīng)組配出國(guó)審和省審品種浚單509、浚單3136、永優(yōu)618，均表現(xiàn)出高抗南方銹病。由于浚M9的一般配合力較高、抗南方銹病強(qiáng)的特點(diǎn)，鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種家利用群內(nèi)改良的方法，將浚926（源于昌7-2和京7黃二環(huán)系）與浚M9雜交選育出浚M98、浚M97、浚96等系列高配合力自交系。但從大田生產(chǎn)觀察到，浚M98、浚M97、浚96抗南方銹病能力不如浚M9，利用抗南方銹病主效基因CML496-RppC特異引物對(duì)CML496-allele-speicific-F/R在浚M98、浚M97、昌7-2上沒(méi)有擴(kuò)增出特異條帶，推測(cè)浚M98、浚M97、浚96的RppC基因區(qū)段可能源自昌7-2。鄭58、昌7-2均沒(méi)有抗南方銹病CML496-RppC類型基因。從大田抗性觀察，鄭單958抗南方銹病較差。特異引物對(duì)CML496-allele-speicific-F/R能擴(kuò)增出CML496-RppC類型基因序列，得到啟示可以利用浚M9（塘四平頭）為供體，以CML496-allele-speicific-F/R為分子標(biāo)記，對(duì)昌7-2、浚M98、浚M97、浚M96進(jìn)行精準(zhǔn)回交改良?？?036、浚6366、浚6368、浚6313、浚50X、浚58、浚208A、浚3665、浚351、浚JC125是鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院近年來(lái)新選育的優(yōu)良自交系，大多數(shù)材料均利用先玉366的二環(huán)系與其他材料雜合選育而來(lái)。這個(gè)二環(huán)系主要優(yōu)點(diǎn)是株型較好、抗病性強(qiáng)，推測(cè)上述材料的抗南方銹病基因源于先玉366二環(huán)系。MD15是福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所和貴州省農(nóng)科院旱糧所合作選育的Suwan-Iodent（蘇艾）種質(zhì)自交系，目前在黃淮海地區(qū)已經(jīng)組配出多個(gè)組合，具有較好的抗病性和抗逆性，蘇艾熱帶種質(zhì)可以作為黃淮海玉米育種的抗源供體[14-16]。

玉米結(jié)實(shí)性受花粉活力、花絲活力及雌花育性影響。對(duì)浚單系列玉米花絲活力研究表明，浚單系列玉米在吐絲后6 d授粉，花絲活力與對(duì)照相當(dāng)，之后活力下降[17-18]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院對(duì)浚M9進(jìn)行花粉耐高溫鑒定，結(jié)論是優(yōu)于對(duì)照。在本試驗(yàn)中，除5個(gè)自交系外，其他19個(gè)自交系調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動(dòng)子區(qū)PCR均擴(kuò)增目標(biāo)條帶（圖3）。將這5個(gè)自交系用玉米actin特異引物擴(kuò)增，均擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，推測(cè)在這5個(gè)自交系G49-3-F/R引物區(qū)可能存在堿基變異，導(dǎo)致G49-3-F/R引物不能配對(duì)。掖478具有較低的敗育率，從而使行粒數(shù)增加、穗長(zhǎng)增加。調(diào)控雌花育性基因ZmACO2啟動(dòng)子區(qū)PCR及測(cè)序顯示，13個(gè)自交系序列與掖478一致。這些自交系主要為瑞德、改良瑞德類，在育種上主要作為母本材料利用，制種產(chǎn)量較高。表明鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜交玉米結(jié)實(shí)性好是有多方面因素的，既有母本雌花育性高，又有父本花粉活力高，這些性狀很好的遺傳給了雜交后代。與浚M98序列一致的除浚351是PB種質(zhì)，其他3個(gè)均是塘四平頭種質(zhì)，這也可能是生產(chǎn)上觀察到部分作父本材料的塘四平頭種質(zhì)雌穗稍短的原因。當(dāng)然，玉米穗長(zhǎng)、行粒數(shù)受多個(gè)基因調(diào)控，本課題組將持續(xù)關(guān)注國(guó)際研究最新進(jìn)展，以便將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為應(yīng)用研究，培育出更多優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)玉米新品種。