規(guī)律血液透析患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的檢測與思考

馮濤 張潔 徐媛琴 陳焱 王彩麗

調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是一類能控制自身免疫反應的T 細胞亞群，CD4+CD25+Treg 作為最重要一類調(diào)節(jié)性T 細胞，是參與抑制自身反應性T 細胞的增殖，維持機體免疫耐受的重要因素[1]。Treg 表達的異?？赡茉斐苫颊呙庖吖δ艿奈蓙y，是腎臟病患者容易合并嚴重感染、腫瘤等并發(fā)癥的重要影響因素之一[2]。筆者希望通過本研究觀察終末期腎臟病血液透析患者透析期間CD4+CD25+Treg 的水平及功能變化，尋找到一條改善血液透析患者免疫功能失調(diào)的道路，為提高血液透析患者生存質量提供新的治療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年1 月—2020 年12 月期間于包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科收治的20 例準備開始血液透析治療的終末期腎病患者為觀察組，男12 例，女8 例，年齡30～70 歲，平均（51.30±8.65）歲。納入標準：（1）所有患者均符合慢性腎衰竭尿毒癥的診斷標準，并被診斷為慢性腎衰竭尿毒癥即血肌肝（serum creatinine，Scr）大于707 pmol/L；（2）患者納入前未進行過腎臟替代血液透析治療；（3）血糖、血壓等并發(fā)癥控制穩(wěn)定；（4）患者及其家屬知情了解并配合研究。排除標準：（1）腫瘤、全身免疫系統(tǒng)疾??；（2）近8 周內(nèi)使用影響免疫功能藥物；（3）近期患有急性感染性疾病、病情危重或存在嚴重心、肝、腦等多臟器功能衰竭以及血糖控制不佳的糖尿病患者；（4）出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥和不良事件、病情迅速惡化的，應及時中止試驗。健康對照組20 例，均為健康志愿者，血清學及肝腎功能檢查正常，排除存在系統(tǒng)疾病及腫瘤的人群，年齡30～70 歲，其中男、女各10 例，平均（49.10±9.33）歲。兩組患者年齡、性別、尿毒癥病程和腎衰病史等資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有臨床可比性。研究經(jīng)我院倫理委員會審核同意，所有參與患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

所有患者均行常規(guī)碳酸氫鹽透析，透析時間4 h/次，3 次/周，使用低分子肝素鈣（國藥準字：H2006019，廠家：深圳賽保爾藥業(yè)有限公司，劑量：5 000 U）抗凝，透析器膜為聚砜膜空心纖維透析器F15（廠家：山東威高血液凈化制品股份有限公司，產(chǎn)地：山東威海），膜面積為1.5 m2，血流量200～250 ml/min，透析液流量500 ml/min，透析患者存在程度不等的腎性貧血，采用重組人紅細胞生成素（國藥準字：S20133011，廠家：深圳賽保爾藥業(yè)有限公司，劑量：10 000 U）糾正貧血，劑量為50～150 U/（kg·w），鈣磷代謝及全段甲狀旁腺激素（Intact Parathyroid Hormone，iPTH）基本達標。

1.2.2 主要儀器和試劑

抗CD4 抗體（克隆號RPA-T4，熒光素BB515，貨號564419，美國BD公司）、抗CD25抗體（克隆號M-A251，熒光素BV421，貨號562442，美國BD 公司）、抗CD127 抗體（克隆號HIL-7R-M21，熒光素PE-Cy7，貨號560822，美國BD 公司）。PBS（廠家：北京索來寶科技有限公司，規(guī)格：500 ml，貨號：P1020，產(chǎn)地：北京）。流式細胞儀（美國BD 公司，型號BD FACSVerse）。采用自動生化分析儀檢測患者血肌酐、尿素氮、血鈣及血磷。采用購自美國R&D 公司的IL-10 試劑盒，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中IL-10 含量。

1.2.3 方法

用流式細胞術測定外周血CD4+CD25+CD127lowTreg細胞，觀察組分別于首次透析治療前、規(guī)律透析6 個月的時間點采集當日透析前靜脈血3 ml，對照組于入組當日，入組6 個月的時間點采集晨起空腹靜脈血 3 ml，每管血給予相應編號；取外周血100 μl，每管加入相應的熒光素偶連抗體，包括抗CD4 抗體、抗CD25 抗體、抗CD127 抗體各1 μl，4℃避光染色30 min 后，加入2 ml 裂紅液（實驗室配置）裂紅8 min，后加入2 ml PBS緩沖液混勻離心 500 g，5 min，棄去上清，加入1 ml 含1%多聚甲醛的PBS，室溫孵育30 min 后離心500 g，5 min，棄上清液后300 μl 重懸上流式細胞儀檢測，結果分析軟件為FlowJo（發(fā)明人：Leonard Herzenberg，版本號：V10，產(chǎn)地：美國斯坦福大學）。

1.3 觀察指標

觀察組分別在透析首日以及透析6 個月，透析前進行抽血化驗，并記錄血清尿素氮、血肌酐、血鈣、血磷、甲狀旁腺功能以及IL-10 化驗結果；流式細胞術檢測CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞；而對照組不需要血液透析，只在實驗首日及6 個月的相同時間點進行相同的化驗；最后分別進行比較。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件和Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用（n，%）表示，采用χ2檢驗；計量資料用（）表示，采用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。認為有統(tǒng)計學意義。結果以（）表示。

2 結果

2.1 腎功及鈣磷代謝指標

觀察組透析前血尿素氮、肌酐升高明顯;且存在鈣磷代謝紊亂，全段甲狀旁腺激素超過正常3 倍。透析6個月各項指標得到一定程度的好轉；對照組各項指標均在正常范圍以內(nèi)；見表1。

2.2 外周血IL-10 分布情況

觀察組與對照組相比實驗首日IL-10 含量百分比差異有統(tǒng)計學意義（t=16.77，P＜0.05）；觀察組患者的IL-10 含量在治療6 個月時較治療前明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（t=18.7，P＜0.05）；但治療6 個月時觀察組患者IL-10 含量仍然低于對照組水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.53，P＜0.05），見表1。

表1 患者的臨床資料（）

表1 患者的臨床資料（）

2.3 外周血調(diào)節(jié)性T 細胞分布情況

圖1 為真實實驗時的情況，觀察組與對照組中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞的含量。圖2 中，觀察組患者血液透析前CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞比例（2.09±0.26）水平均低于對照組（8.45±1.06），差異有統(tǒng)計學意義（t=26.060，P＜0.05），見圖2A；透析治療6 個月后較治療透析前CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞比例水平上升，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.34，P＜0.05），見圖2D。且治療6 個月后，觀察組患者CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞比例水平（3.50±0.36）仍低于對照組（7.87±1.34），差異有統(tǒng)計學意義（t=14.085，P＜0.05），見圖2B；對照組CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞比例2 次結果無明顯變化，見圖2C。

圖1 觀察組與對照組中CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞的含量

圖2 各組CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞的含量比較

3 討論

1995 年首次發(fā)現(xiàn) CD4+CD25+Treg 細胞，其來源于胸腺，是一類能夠控制自身免疫應答及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的細胞群[3]。2002 年正式定義 Treg 細胞是一種獨立的具有調(diào)節(jié)功能的 T 細胞亞群。隨后逐漸發(fā)現(xiàn)Treg 細胞的調(diào)節(jié)功能與細菌感染、自身免疫性疾病、腫瘤免疫、移植耐受等疾病均相關。3 叉頭狀/翅膀狀螺旋轉錄因子（forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3）目前發(fā)現(xiàn)的CD4+CD25+Treg 細胞分化過程中最好的標記物[4]。但由于Foxp3 存在于細胞漿內(nèi)，需要破膜打孔后才能檢測，很容易破壞細胞的活性，臨床工作中不適合分選，如何選擇更好的組合，獲得更好的標志物，始終是一個問題。研究發(fā)現(xiàn)IL-7 的受體CD127 與Foxp3 的表達存在著關聯(lián)性[5]。后來研究發(fā)現(xiàn)CD127 的高表達存在于CD4+T 細胞的整個細胞周期，與之相反，調(diào)節(jié)性T 細胞中CD127 卻是一個低表達狀態(tài)，因此在幫助識別調(diào)節(jié)性T 細胞和記憶性T 細胞表面標記物方面，CD127 發(fā)揮著重要的作用；并且進一步研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T 細胞的細胞胞漿中Foxp3 與細胞胞膜中CD127 之間存在聯(lián)系，即胞漿中Foxp3 的高表達（Foxp3high）與包膜中 CD127 的低表達（CD127low）可能密切相關且為同一細胞群，CD127 主要存在于正常人外周血中成熟的T 細胞表面；體外實驗表明，具有抑制活性的調(diào)節(jié)性T 細胞表面的CD127 更容易被檢測到。因此，目前認為CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞在臨床應用中更具價值[6]。

在大多數(shù)炎性疾病（包括急性和慢性腎臟疾?。┑难芯恐?，Treg 的耗竭會加重疾病，而Treg 的補充可提供強有力的保護[7-9]。雖然腎臟只占身體重量的1%，但流入腎臟的血流能占到心輸出量的25%，腎臟疾病會導致腎臟聚集大量體內(nèi)代謝的物質，從而誘發(fā)腎臟炎性病變，腎臟炎性疾病的主要影響是血流，腎皮質（50 mmHg）和髓質（10～20 mmHg）之間的血流和氧分壓差分布使得髓質對缺氧特別敏感[10-12]。腎臟疾病的發(fā)生往往繼發(fā)于其他疾病，世界范圍內(nèi)糖尿病腎病一直是慢性腎衰竭的最大殺手；另外自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE），有一半的患者中表現(xiàn)為免疫復合物沉積相關的腎臟病，并且高達10%的患者出現(xiàn)腎功能衰竭[13]。還有其他一些腎臟疾病，如IgA 腎病、膜性腎小球病、局灶性節(jié)段性腎小球腎炎等，都因免疫系統(tǒng)而惡化，這些患者中有很大一部分進入終末期腎病[14]。上述疾病炎癥在其發(fā)病過程中都起著重要的作用。因此，可以預見有效的干預炎癥的策略對于腎臟病應該是有益的，而Treg 已經(jīng)被證明防止免疫系統(tǒng)的過度激活最有力的執(zhí)行者。然而終末期腎臟病患者與Treg 的相關性卻很少有研究。終末期腎臟病由于多種毒素的存在，導致Treg 的耗竭，當Treg 減少時，對T 細胞和B 細胞抑制減弱，引導變化中的CD4+T 細胞成為致病性的T 細胞，導致尿毒癥患者免疫功能受損或紊亂。另外其相關細胞因子TGF-β1、IL-10 等也可起到抑制炎性細胞因子和趨化因子產(chǎn)生的作用[15]。雖然持續(xù)血液透析治療可以通過內(nèi)毒素的清除，使終末期腎臟病患者的免疫缺陷狀況得到部分改善。但比較于正常人群仍處于一個較為低下狀態(tài)；從而，免疫功能缺陷已經(jīng)成為嚴重威脅終末期腎病患者生命的重要因素之一。因此監(jiān)測血液透析患者的免疫功能指標，對于判斷病情發(fā)展趨勢以及有效指導治療至關重要。

筆者通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，終末期腎臟病患者通過規(guī)律血液透析治療會改善生存質量，但透析期間，很多患者因感染疾病而導致的死亡的發(fā)生率仍然很高，是否間接也反應了透析并未根本糾正機體的免疫缺陷。本研究通過檢測初始透析到透析半年以后這個階段患者外周血中調(diào)節(jié)性T 細胞的分布，并且與正常健康人群相比較，發(fā)現(xiàn)患者首次透析前CD4+CD25+CD127lowTreg 細胞及IL-10 的比例明顯低下，證明終末期腎病患者可能存在免疫功能受損。維持性血液透析后上述項指標均較前有所上升，但比值仍明顯低于正常人群，說明終末期腎病患者通過血液透析治療后，機體的免疫功能得到了部分恢復，但仍不能恢復到正常健康人群水平。另外，攝入不足、血液透析中營養(yǎng)物質的丟失也可導致尿毒癥透析患者細胞免疫功能低下，終末期腎病患者本身的原發(fā)病存在細胞免疫紊亂及免疫損傷也是導致免疫功能缺陷的重要原因，本研究盡量減少了這些影響因素。最終結果證實Treg 與慢性腎臟病密切相關，反映了終末期腎病患者體內(nèi)可能的免疫低下的原因，以及血液透析可部分改善上訴情況，為通過血液透析改善調(diào)節(jié)免疫功能提供參考資料。