Hippo 通路核心蛋白在小鼠出生后不同時(shí)間點(diǎn)腦皮質(zhì)中的表達(dá)變化

陳禹，李希凡，李凱璇，陳晨，黃希仕，方方*

1.桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，桂林 541004

Hippo 信號(hào)通路是一個(gè)調(diào)控組織器官大小及細(xì)胞增殖、分化和凋亡的高度保守的重要信號(hào)通路[1]，于1995年因果蠅Warts（Wts）基因突變引起器官過(guò)度增長(zhǎng)而被人發(fā)現(xiàn)[2]。這一通路在果蠅中的核心成分有Hpo、SAV（Salvador）、Wts、Mats 及Yki，它們?cè)诓溉閯?dòng)物中的同源蛋白分別是MST1/2（Mammalian Ste20-like kinases 1/2）、SAV1、LATS1/2（Larger tumor suppressor 1/2）、MOB1（MOB kinase activator 1A/B）和YAP（Yes-associated protein）[3]，在哺乳動(dòng)物經(jīng)典Hippo信號(hào)通路被激活后，MST1/2 會(huì)與SAV1 形成復(fù)合物，當(dāng)MST1/2 在Thr183/Thr180 磷酸化會(huì)激活LATS1/2-MOB1A/B，激活的復(fù)合物隨后磷酸化MOB1-Thr35 并使YAP 的Ser127 磷酸化，磷酸化的YAP 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)從而抑制其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制[4]，反之，當(dāng)Hippo 信號(hào)通路受到抑制、YAP 就會(huì)在核中聚集形成多種與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的復(fù)合物。目前關(guān)于哺乳動(dòng)物出生后早期Hippo 信號(hào)通路與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的中文和英語(yǔ)文獻(xiàn)，多是胚胎發(fā)育期的研究，本文通過(guò)對(duì)出生后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠皮質(zhì)中Hippo信號(hào)通路核心蛋白MST1、LATS1 的表達(dá)變化以及YAP 在皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞中的定位，對(duì)Hippo 信號(hào)通路在小鼠出生后神經(jīng)發(fā)生中的作用進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑

兔抗MST1 多克隆抗體、兔抗LATS1 多克隆抗體、兔抗YAP 單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，鼠抗GAPDH 單克隆抗 體、兔抗IBA1 多克隆抗體購(gòu)自Proteintech，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 均購(gòu)自Jackson Immuno Research Laboratories。多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自愛(ài)必信生物科技有限公司。Western 及IP 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物有限公司、PageRuler 預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Thermo Fisher Scientific Inc.公司，PAGE 凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

本實(shí)驗(yàn)所用健康成年C57BL/6 小鼠購(gòu)買(mǎi)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK 湘2019-0004），飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK 桂2020-0005）。按照雌雄比2:1 合籠，待雌鼠懷孕后，將雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，雌鼠產(chǎn)下的子代用做實(shí)驗(yàn)，子代雌雄隨機(jī)。在子代出生后（postnatal，P）3 d、6 d、9 d、3 周和8 周時(shí)取材，其中，P3d、P6d 和P9d 為出生后早期[5]，P3 周為斷乳期，P8 周為成體期。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取8 只，4 只開(kāi)顱后立即稱(chēng)腦重再進(jìn)行腦區(qū)分離用于后續(xù)Western Blotting 檢測(cè)，4 只灌流用于后續(xù)免疫組織化學(xué)以及腦橫徑檢測(cè)。

1.3 Western Blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

在研磨器中加蛋白裂解液至于冰中，冰上操作分離1.2 中用于Western Blotting 檢測(cè)的小鼠的皮質(zhì)區(qū)，放入已加入蛋白裂解液的研磨器中研磨，研磨充分后將蛋白移入EP 管中，超聲3 次，超聲間隙置冰上孵育，充分裂解后，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。后續(xù)步驟如文獻(xiàn)[6]所述，使用NC 膜，10%分離膠，一抗稀釋濃度分別為GAPDH 1:50000、MST1 1:1000、LATS1 1:1000，ECL 發(fā)光顯影。

1.4 多重?zé)晒饷庖呓M化染色

酪胺信號(hào)放大（Tyramide signal amplification，TSA）技術(shù)采用HRP 標(biāo)記的二抗，HRP 催化加入體系的熒光素底物，生成活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸共價(jià)結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定地共價(jià)結(jié)合熒光素。之后用熱修復(fù)洗去非共價(jià)結(jié)合的抗體，再換下一種一抗來(lái)第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復(fù)可實(shí)現(xiàn)使用同一種屬來(lái)源的一抗多重標(biāo)記。YAP 和IBA1 分別孵育TSA 單色熒光染料520 和570，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照多重?zé)晒饷庖呓M化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)。染色腦片選取耳間冠狀面前2.5 mm 至2.3 mm 間的腦片，共聚焦拍攝時(shí)選取緊鄰正中線兩側(cè)的額葉部。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western Blot 目的條帶用Image LabTM software Version 3.0 進(jìn)行分析，以目的條帶/內(nèi)參條帶的比值代表目的蛋白表達(dá)的相對(duì)水平，每組實(shí)驗(yàn)以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)，將所測(cè)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Image pro plus對(duì)免疫熒光圖片進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果均使用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間進(jìn)行ttest 法分析，多組間進(jìn)行ANOVA 法分析，當(dāng)P＜0.05 時(shí)即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠在出生后五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的腦重變化情況

腦重是衡量小鼠腦組織生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)之一，在P3d、P6d、P9d、P3 周和P8 周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行腦重測(cè)量，結(jié)果顯示：除P3 周和P8 周組比較無(wú)顯著性差異外，其余各組兩兩比較均有顯著性差異（圖1，表1），小鼠出生后早期到P3 周，腦重呈逐漸升高態(tài)勢(shì)、增速顯著，從斷乳期P3 周到成體期P8 周，腦重水平無(wú)顯著變化。

圖1 小鼠在出生后5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦重變化情況與P3d組相比，***P＜0.001，n=4Fig.1 The changes of brain weight in mice at five different time points after birth***P＜0.001,compared with the P3d group, n=4

2.2 小鼠在出生后5 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的腦橫徑變化情況

當(dāng)小鼠P3d、P6d、P9d、P3 周和P8 周時(shí)，在小鼠耳間冠狀面前0.64 mm 處測(cè)量腦橫徑。結(jié)果顯示：腦橫徑隨著時(shí)間推移不斷增加，出生后早期腦橫徑增速明顯。P8 周與P3 周相比腦橫徑雖顯著增加，但增加速率低于出生后早期3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（圖2，表1）。

圖2 小鼠在出生后5 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的腦橫徑變化情況A：五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠腦橫徑圖片B：腦橫徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果 與P3d組相比，**P＜0.01，***P＜0.001，n=4Fig.2 The changes of brain transverse diameter in mice at five different time points after birthA: The pictures of brain transverse diameter of mice at five different time points; B: Statistical results of brain diameter **P＜0.01,***P＜0.001,compared with the P3d group, n=4

2.3 LATS1 和MST1 在小鼠出生后五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)中的蛋白表達(dá)變化

LATS1 和MST1 是Hippo 信號(hào)通路上游的兩個(gè)關(guān)鍵通道蛋白，其表達(dá)變化可以作為衡量Hippo 信號(hào)通路是否激活的指標(biāo)之一。在對(duì)5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠皮質(zhì)進(jìn)行Western Blotting 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：與P3 d組相比，P9 d 之后LATS1 蛋白水平開(kāi)始逐步顯著性降低，P3周組和P8 周組蛋白水平降幅最大，LATS1 蛋白水平在P3 周與P8 周無(wú)組間差異（圖3A 和B）；與P3d組相比，MST1 在P6d、P9d、P3 周和P8 周蛋白水平顯著降低，與P6 d 相比，MST1 在P9 d 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、在P3周和P8 周時(shí)蛋白水平顯著降低，與P3 周組相比，P8周組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A 和C）。

圖3 A：LATS1 和MST1 的免疫印記圖B：LATS1 蛋白相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖C：MST1 蛋白相對(duì)定量統(tǒng)計(jì)圖 與P3d組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，n=4Fig.3 A: Immunoblot diagram of LATS1 and MST1; B: Relative quantitative statistical diagram of LATS1; C: Relative quantitative statistical diagram of MST1;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,compared with the P3d group, n=4

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠出生后5 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)中的計(jì)數(shù)及YAP 定位分析

Hippo 信號(hào)通路的核心是激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)Hippo 信號(hào)通路被激活后，上游的MST1/2 與SAV 結(jié)合形成復(fù)合體，激活并磷酸化LATS1/2，后者進(jìn)而磷酸化YAP，磷酸化后的YAP 會(huì)出核滯留在胞漿中，反之，YAP 會(huì)停留在細(xì)胞核內(nèi)參與形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。因此，YAP 在細(xì)胞核內(nèi)、核外的定位是判定Hippo 信號(hào)通路激活與否的關(guān)鍵。

出生后大腦神經(jīng)細(xì)胞中數(shù)目發(fā)生改變的通常是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞就是其中一種。本實(shí)驗(yàn)使用IBA1 作為小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，利用IBA1 和YAP 對(duì)腦片進(jìn)行免疫熒光共定位，計(jì)數(shù)小鼠出生后不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目并檢測(cè)分析YAP 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的定位情況。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，隨小鼠鼠齡增長(zhǎng)，皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞百分比逐漸上升，但從P3 周開(kāi)始，小膠質(zhì)細(xì)胞增速顯著放緩（圖4 和5A，表2）。伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多的是YAP 在小膠質(zhì)細(xì)胞中從核外轉(zhuǎn)向核內(nèi)聚集（圖4 和5B，表2）。

圖4 皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞及YAP 變化情況A：P3d組B：P6d組C：P9d組D：P3 周組E：P8 周組圖中黃色為IBA1 所染的小膠質(zhì)細(xì)胞，綠色為YAP 10X 圖片標(biāo)尺為100 μm，40X 圖片標(biāo)尺為20 μmFig.4 The changes of microglia and YAP in cortexA: P3d group; B: P6d group; C: P9d group; D:P3w group; E: P8w group;The microglia stained by IBA1 in yellow and YAP in green,the scale bar in the 10X picture was 100 μm,the scale bar in the 40X picture was 20 μm

表2 小膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠出生后5 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)的變化情況以及YAP 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況（%）Tab.2 The changes of microglia in the cortex of mice at five different time points after birth and the expression of YAP in microglia（%）

3 討論

Hippo 信號(hào)通路于1995年因果蠅Warts（Wts）基因缺失引起器官過(guò)度增長(zhǎng)而被發(fā)現(xiàn)[2]，Warts（Wts）在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白就是LATS1/2（Larger tumor suppressor 1/2）,除LATS1/2 外，哺乳動(dòng)物Hippo 信號(hào)通路的核心成分還有MST1/2（Mammalian Ste20-like kinases 1/2）、SAV1、MOB1（MOB kinase activator 1A/B）和YAP（Yes-associated protein）[3]。MST1/2 可通過(guò)磷酸化LATS1/2 的C 端疏水基序，促進(jìn)LATS1/2 的自磷酸化而被激活[7]，也可通過(guò)磷酸化MOB1，使LATS1/2 的活性抑制被解除而激活[8]，但最終Hippo 信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控組織器官大小及細(xì)胞增殖、分化和凋亡的高度保守的[1]作用還是依靠YAP。LATS1/2 激活可以使YAP-Ser127 磷酸化,使得YAP 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)從而阻止其行使轉(zhuǎn)錄激活功能,反之,YAP 入核與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)[4]。

神經(jīng)發(fā)育障礙是一組在發(fā)育階段起病的疾病，孤獨(dú)癥（自閉癥）譜系障礙（Autistic spectrum disorder，ASD）就是其中具有代表性的一種，社會(huì)交流缺陷、社交互動(dòng)中使用非語(yǔ)言交流行為的缺陷以及重復(fù)刻板行為是ASD 的核心癥狀[9]并伴隨患者終生。2020年1篇全國(guó)范圍的ASD 統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示我國(guó)患病率約為0.95%，但文中也指出由于對(duì)該病的公眾意識(shí)不足、調(diào)查對(duì)象主要來(lái)源于城市人口，實(shí)際患病率會(huì)更高[10]。因?yàn)閷?duì)ASD 病因及發(fā)病機(jī)制了解有限，尚無(wú)針對(duì)核心癥狀的治療藥物。作為廣泛性發(fā)育障礙的代表性疾病，ASD 的大腦發(fā)育一直被關(guān)注，2017年就有研究指出ASD 患兒在出生后6-12月頭圍增大且皮質(zhì)表面積的擴(kuò)張速度遠(yuǎn)超正常人[11]；國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也顯示有90%的ASD 患兒在2～4 歲時(shí)全腦體積大于正常兒童，在頂葉、枕葉、額葉、顳葉和楔前葉等區(qū)域皮層厚度均高于正常兒童，而成年時(shí)則無(wú)顯著差異[12]。類(lèi)似的研究結(jié)果也出現(xiàn)在ASD 動(dòng)物模型中，我國(guó)學(xué)者在丙戊酸鈉（Valproic acid，VPA）孤獨(dú)癥大鼠中發(fā)現(xiàn)腦橫徑在出生后早期增大而后恢復(fù)正常[13]，以上研究均表明，不管是ASD 患者還是動(dòng)物模型，在出生后大腦早期發(fā)育時(shí)大都經(jīng)歷了體積先增大后恢復(fù)正常的過(guò)程。根據(jù)Hippo 信號(hào)通路的上述特點(diǎn)，我們推測(cè)ASD 患者或動(dòng)物模型出生后早期頭顱過(guò)大及腦容量增加可能與Hippo 信號(hào)通路異常有關(guān)。但當(dāng)我們查找哺乳動(dòng)物出生后早期Hippo 信號(hào)通路與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的中文和英語(yǔ)文獻(xiàn)時(shí)，查找到的多是胚胎發(fā)育期的研究[14]，于是我們決定先對(duì)出生后早期Hippo 信號(hào)通路進(jìn)行相關(guān)研究。

圖5 小膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠出生后5 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)的變化情況以及YAP 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況A：小膠質(zhì)細(xì)胞百分比B：YAP 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況 與P3d組相比，**P＜0.01，***P＜0.001，n=3Fig.5 The changes of microglia in the cortex of mice at five different time points after birth and the expression of YAP in microgliaA: the percentage of microglia; B: the expression of YAP in microglia;**P＜0.01,***P＜0.001,compared with P3d group, n=3

根據(jù)Science 的文獻(xiàn)我們將C57BL/6 小鼠P3、6、9 d 作為出生后早期，P8 周作為成體期[5]，此外還增加了P3 周作為斷乳期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，出生后早期小鼠腦重和腦橫徑快速增長(zhǎng)，伴隨快速增長(zhǎng)的是Hippo 信號(hào)通路核心蛋白MST1、LATS1 和p-YAP-S127 顯著升高。在對(duì)額葉中小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，IBA1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目在出生后早期增速明顯，在與YAP 共定位后發(fā)現(xiàn)YAP 多分布在胞質(zhì)中，以上結(jié)果證明Hippo信號(hào)通路在小鼠出生后早期皮質(zhì)中被激活。

綜上，Hippo 信號(hào)通路可能參與出生后早期皮質(zhì)發(fā)育調(diào)控進(jìn)而確保出生后大腦正常發(fā)育。理論上認(rèn)為，體積的增大可能與細(xì)胞數(shù)目增多有關(guān)，這說(shuō)明小鼠出生后早期應(yīng)該存在神經(jīng)新生，但Hippo信號(hào)通路如何在此過(guò)程中發(fā)揮作用，依舊需要進(jìn)一步深入研究。