整合的HBV DNA在慢性乙型肝炎患者病毒復(fù)制及慢性感染維持中的潛在作用

李玉坤 顧智強(qiáng) 姜倩倩 陳香梅 魯鳳民

慢性感染是乙型肝炎病毒(HBV)最主要的致病形式。而以微小染色體形式存在于感染肝細(xì)胞核的長(zhǎng)度3.2 kb的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)對(duì)于病毒復(fù)制及慢性感染的持續(xù)至關(guān)重要，并與慢性乙型肝炎(CHB)難以治愈和抗病毒治療停藥后的病毒反彈及疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。作為病毒復(fù)制的源頭，cccDNA可以轉(zhuǎn)錄出超基因組全長(zhǎng)的3.5 kb前基因組RNA(pgRNA)和亞基因組RNA(2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb RNAs)[1]，其中pgRNA既是編碼病毒核心蛋白(core)和具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的病毒DNA聚合酶蛋白(polymerase, pol)的mRNA，也是在由core蛋白構(gòu)成的核衣殼內(nèi)pol蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成子代病毒基因組——松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)負(fù)鏈的模板[2]。在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，pol蛋白需要完成三次正確的跳轉(zhuǎn)才能產(chǎn)生子代rcDNA，若pol蛋白未發(fā)生第二次跳轉(zhuǎn)，而在原位啟動(dòng)正鏈DNA的合成，則會(huì)形成雙鏈線性DNA(Double strand linear DNA，dslDNA)[3]。本文回顧了現(xiàn)有的與HBV DNA整合相關(guān)的知識(shí)體系，特別是其能否通過(guò)產(chǎn)生和提供病毒包膜蛋白HBsAg及羧基端缺失的HBx蛋白等參與支持病毒的復(fù)制，及其在慢性HBV感染維持中的潛在作用。

一、HBV DNA整合的分子機(jī)制及表達(dá)特征

目前已知dslDNA是整合HBV DNA的前體和來(lái)源，可通過(guò)非同源末端連接或微同源末端連接等方式隨機(jī)地整合至宿主DNA雙鏈斷裂處[4]。這里，我們通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期數(shù)據(jù)及網(wǎng)上可用的HBV整合的病毒斷點(diǎn)數(shù)據(jù)的再分析，對(duì)整合的病毒片段斷點(diǎn)的分布特征提出了新的觀點(diǎn)。不同于既往的整合病毒DNA斷點(diǎn)分布于DR1及DR2間的籠統(tǒng)敘述，我們認(rèn)為正確的表述應(yīng)該是：下游斷點(diǎn)多集中在dslDNA下游端點(diǎn)的DR1殘存(1827nt，不同基因型間的脫氧核苷酸序號(hào)可能存在差異，下同)周?chē)嫌螖帱c(diǎn)則位于pgRNA 5'端殘留起始(1818nt)至上游DR1(含該DR1的1824-1834nt重復(fù)序列)區(qū)域附近(圖1)。這一表述與dslDNA的兩端斷點(diǎn)一致，更符合dslDNA為整合病毒DNA前體(precursor)的推測(cè)[5-6]。而之所以在實(shí)測(cè)的臨床樣本中出現(xiàn)斷點(diǎn)自dslDNA兩端內(nèi)移的現(xiàn)象，多是因?yàn)檎系牟《?宿主融合位點(diǎn)微小區(qū)域的染色體不穩(wěn)定性[2]，及伴隨著攜帶整合片段肝細(xì)胞在肝臟炎癥壞死后的代償性克隆擴(kuò)增帶來(lái)的病毒序列的微小缺失等改變所致。

從眾多已知的整合病毒DNA的兩端斷點(diǎn)推測(cè)，整合的HBV DNA序列多保留有完整的編碼大、中、小表面抗原的preS/S區(qū)及羧基端部分缺失的X基因區(qū)(圖1)，該推測(cè)被近期的一系列基因組長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果所證實(shí)[7]。由此以來(lái)，整合的HBV DNA能夠在其自身啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄出對(duì)應(yīng)的2.4、2.1 kb 轉(zhuǎn)錄本及能夠翻譯出羧基端缺失并融合了部分宿主基因組序列的X基因轉(zhuǎn)錄本。既往研究也證實(shí)，整合HBV DNA可以支持乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)和羧基端截短的HBx蛋白的表達(dá)[8-9]。同時(shí)，由于啟動(dòng)子移位無(wú)法轉(zhuǎn)錄出超基因組全長(zhǎng)的3.5 kb的pgRNA，“有缺陷”的整合HBV DNA不能單獨(dú)支持子代病毒基因組rcDNA的產(chǎn)生[10]。

二、HBV DNA整合與肝細(xì)胞癌發(fā)生

由于病毒DNA整合入宿主基因組事件可發(fā)生于包括感染早期在內(nèi)的任何階段，且其在人染色體上整合具有隨機(jī)性，不同自然病程的CHB患者肝組織中均可以檢測(cè)到獨(dú)特的病毒-宿主DNA融合的整合事件[11]。目前關(guān)于HBV整合的研究多聚焦于整合事件的致肝細(xì)胞癌(HCC)作用。機(jī)理上，已知HBV DNA整合可通過(guò)以下三種主要機(jī)制促癌：(1)擾亂宿主癌基因的表達(dá)及其功能，包括細(xì)胞增殖等促癌基因如TERT、CCNE1和MLL4等的激活[12]，及抑癌基因的功能失活等[5]；(2)促進(jìn)宿主染色體特別是整合位點(diǎn)局部基因組的不穩(wěn)定性[13-14]；(3)野生型和截短/融合病毒蛋白(HBx、preS/S)的致癌作用[15]。一般認(rèn)為，HBV DNA整合的上述致HCC作用是與病毒所致肝臟的炎癥微環(huán)境相互作用的綜合結(jié)果，炎癥所致肝細(xì)胞的死亡誘導(dǎo)了殘余肝細(xì)胞的再生，而攜帶上述整合的肝細(xì)胞會(huì)因具有增殖優(yōu)勢(shì)而被克隆性擴(kuò)增，并積累更多的突變最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生。

三、HBV DNA整合對(duì)病毒復(fù)制的影響及其慢性感染維持中的可能作用

目前，人們對(duì)于整合的HBV在病毒復(fù)制及慢性HBV感染維持中的作用仍然知之甚少。誠(chéng)如前面所提，由于整合的HBV DNA前體dslDNA的全長(zhǎng)僅為3.2 kb，無(wú)法轉(zhuǎn)錄出3.5 kb的pgRNA以支撐病毒DNA復(fù)制，故HBV DNA的整合事件被認(rèn)為是錯(cuò)誤跳轉(zhuǎn)帶來(lái)的副產(chǎn)品，這很容易讓人認(rèn)為整合的HBV DNA并不參與病毒的復(fù)制。但對(duì)此也有人持不同的觀點(diǎn)。近期Erken等[16]建立了檢測(cè)CHB患者肝組織中整合HBV DNA水平的半定量巢氏Alu-PCR技術(shù)，并通過(guò)整合HBV DNA水平與患者血清病毒學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析，以期找出HBV DNA整合參與病毒復(fù)制的潛在證據(jù)。盡管我們的工作提示Erken等[17]采用的檢測(cè)整合HBV轉(zhuǎn)錄本的RT-Alu-PCR技術(shù)可能會(huì)漏掉大部分整合HBV的轉(zhuǎn)錄本，但仍應(yīng)重視HBV DNA整合在病毒復(fù)制和慢性感染維持中的作用[18]。據(jù)此，本文總結(jié)了既往的研究發(fā)現(xiàn)，并結(jié)合我們自己的工作，嘗試從以下四方面進(jìn)一步闡述HBV整合在病毒復(fù)制及慢性感染維持中的潛在作用。

(一)整合來(lái)源的HBsAg可為病毒復(fù)制提供包膜并維持持續(xù)感染 慢性HBV感染者血清HBsAg有cccDNA及整合的HBV DNA兩個(gè)來(lái)源，特別是對(duì)于乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性患者，整合的HBV DNA可能是其血清HBsAg的主要來(lái)源[19]。不僅如此，F(xiàn)reitas等發(fā)現(xiàn)，存在HBV DNA整合的PLC/PRF/5細(xì)胞系可以為丁型肝炎病毒(HDV)提供功能性包膜蛋白[20]。有關(guān)整合來(lái)源的HBsAg支持病毒包膜形成的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還包括：由于pol蛋白的逆轉(zhuǎn)錄酶活性缺乏矯正閱讀功能，HBV基因組(cccDNA)的preS/S區(qū)可有高頻的可導(dǎo)致HBV分泌和感染缺陷的突變發(fā)生[21-22]，但在這些CHB患者體內(nèi)卻可檢測(cè)到preS/S區(qū)突變毒株的持續(xù)存在[23]，提示整合HBV DNA來(lái)源的功能性HBsAg可能彌補(bǔ)了preS/S區(qū)突變毒株的缺陷以維持該類(lèi)毒株的持續(xù)感染。如果存在于肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA分子在不同的時(shí)空的某一節(jié)點(diǎn)僅轉(zhuǎn)錄一種病毒轉(zhuǎn)錄本，我們或許可以想象隨著疾病進(jìn)展和病毒與宿主免疫的博弈，HBeAg陰性患者部分肝細(xì)胞核內(nèi)殘留的數(shù)量顯著減少的cccDNA可能只具備轉(zhuǎn)錄pgRNA的能力了。此時(shí)，來(lái)自整合HBV DNA的病毒包膜蛋白將協(xié)助其形成具有感染能力的子代病毒顆粒。當(dāng)然，該推測(cè)尚需更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。

(二)整合的HBV DNA促進(jìn)HBV復(fù)制的可能機(jī)制 整合HBV DNA表達(dá)的野生型或突變型HBsAg均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[24]。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，HBV可利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所啟動(dòng)的自噬作用來(lái)增強(qiáng)HBsAg的產(chǎn)生及HBV的復(fù)制和分泌。此外，HBx通過(guò)促進(jìn)宿主SMC5/SMC6復(fù)合物的降解，增強(qiáng)cccDNA的轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制[26]，為新合成cccDNA獲得轉(zhuǎn)錄活性和活性維持及病毒的持續(xù)復(fù)制所必須[27]。此外，作為共轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，HBx的羧基端(51-154aa)含有可轉(zhuǎn)錄激活cccDNA的反式激活結(jié)構(gòu)域[28]。需要注意的是，整合過(guò)程中dslDNA的末端常發(fā)生缺失突變，由dslDNA兩端向內(nèi)缺失最長(zhǎng)可達(dá)200 bp[29]，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生羧基端不同程度截短的CtHBx，其對(duì)于cccDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可能會(huì)不盡相同，有待進(jìn)一步研究。

圖1 經(jīng)典雙鏈線性DNA的序列特征(以HBV C基因型為例)

(三)整合HBV DNA為HBeAg陰性患者HBsAg主要來(lái)源的可能機(jī)制 盡管高水平的HBeAg和HBsAg具有免疫抑制作用[30-31]，但HBeAg的免疫原性可能更強(qiáng)。因此，在慢性HBV感染的自然進(jìn)程中，往往會(huì)發(fā)生HBeAg的陰轉(zhuǎn)，提示宿主免疫應(yīng)答更傾向于清除表達(dá)HBeAg的cccDNA轉(zhuǎn)錄活躍的肝細(xì)胞，這一過(guò)程往往會(huì)誘發(fā)殘存肝細(xì)胞的代償性增殖，一方面會(huì)導(dǎo)致cccDNA池的進(jìn)一步丟失，一些存在整合的肝細(xì)胞則可能會(huì)因代償性增殖并進(jìn)一步克隆性擴(kuò)增而逐漸增加[32-33]。在長(zhǎng)期的疾病進(jìn)展過(guò)程中，患者的HBeAg發(fā)生陰轉(zhuǎn)或血清學(xué)轉(zhuǎn)換，整合的HBV DNA逐漸成為其HBsAg的主要來(lái)源[34-35]。

(四)整合HBV DNA與CHB患者難以達(dá)到臨床治愈有關(guān) 無(wú)論是自發(fā)，還是經(jīng)過(guò)抗病毒治療，血清HBsAg消失的CHB患者往往有更好的近期和遠(yuǎn)期結(jié)局，并被定義為臨床治愈[36]。盡管人們知道血清HBsAg有cccDNA和整合HBV DNA兩個(gè)來(lái)源，但靶向HBV轉(zhuǎn)錄本3'端共同序列的首個(gè)RNA干擾候選藥物ACR-520在HBeAg陰性的慢性HBV感染黑猩猩中失去顯著抑制血清HBsAg的作用[37]。究其原因在于ACR-520靶向的mRNA序列位于病毒整合下游斷點(diǎn)之后，對(duì)整合來(lái)源pres/s轉(zhuǎn)錄本并無(wú)干擾作用[37]。最近高志良團(tuán)隊(duì)對(duì)CHB患者的HBV DNA整合分析結(jié)果證實(shí)，與未實(shí)現(xiàn)臨床治愈者相比，臨床治愈患者肝組織內(nèi)整合的HBV DNA有著極為明顯的減少[38]，也說(shuō)明了整合HBV DNA來(lái)源的HBsAg的存在使患者難以達(dá)到臨床治愈。

四、小結(jié)

HBV DNA整合一直被認(rèn)為是HCC發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，但隨著對(duì)HBV DNA整合的分子機(jī)制和致病機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，確證了盡管HBV DNA整合不會(huì)產(chǎn)生具有復(fù)制能力的轉(zhuǎn)錄本，但可以表達(dá)大、中和小HBsAg，以及羧基端截?cái)嗟腍Bx。在病毒復(fù)制及慢性感染維持方面，整合的HBV DNA可能在以下幾個(gè)環(huán)節(jié)參與其中：(1)轉(zhuǎn)錄表達(dá)HBsAg為病毒提供包膜以維持HBV的持續(xù)感染；(2)整合來(lái)源的HBsAg和羧基端截?cái)嗟腍Bx可能參與cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)和病毒復(fù)制；(3)在長(zhǎng)期的病毒-宿主相互作用下，肝臟中的整合事件通過(guò)免疫逃逸和肝細(xì)胞克隆性擴(kuò)增而逐漸增加，而cccDNA池則逐漸丟失或轉(zhuǎn)錄沉默，最終可能導(dǎo)致整合的HBV DNA成為HBeAg陰性患者血清HBsAg的主要來(lái)源。除此之外，整合HBV DNA的持續(xù)存在與表達(dá)，可能是CHB特別是HBeAg陰性患者難以治愈的主要原因。未來(lái)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)HBV整合參與病毒復(fù)制及維持慢性感染的作用及相關(guān)機(jī)制的研究，以進(jìn)一步提高CHB患者的臨床治愈。