大河烏豬STARD4基因的分子鑒定、組織表達(dá)、多態(tài)性分析與相關(guān)研究進(jìn)展

李昌武，劉永剛，萬(wàn)長(zhǎng)華，廖 柱

（1.海南羅牛山畜牧有限公司，海南 ?？?570100；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650000）

目前我國(guó)商品豬生產(chǎn)規(guī)模居世界首位，是世界上最大的生豬產(chǎn)出國(guó)，現(xiàn)在中國(guó)一年要生產(chǎn)和消費(fèi)5億頭豬，占全球豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)量近一半。而每個(gè)中國(guó)人平均一年要消費(fèi)掉近40 kg的豬肉，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛羊肉和其他所有肉類(lèi)的總和。1990年城鎮(zhèn)居民平均每人可用于生活費(fèi)的貨幣收入為1 387元，2021年，我國(guó)城鎮(zhèn)居民人均可支配收入47 412元，增長(zhǎng)約35倍[1-2]。隨著人民生活水平的顯著提高，人們?cè)陲嬍沉?xí)慣上出現(xiàn)了明顯差異和變化，從簡(jiǎn)單的對(duì)肉的需要轉(zhuǎn)變成對(duì)優(yōu)質(zhì)、風(fēng)味好、口感佳的豬肉的需求。在對(duì)豬長(zhǎng)期選育培育的過(guò)程中，其體內(nèi)脂肪含量發(fā)生一定變化，尤其是IMF（肌內(nèi)脂肪）含量的變化，對(duì)肉質(zhì)的風(fēng)味及口感都產(chǎn)生一系列的影響。而目前我國(guó)一些本地豬種其IMF含量豐富，且經(jīng)過(guò)雜交改良后能保持其肌內(nèi)脂肪豐富的特性。王忠慶等[3]通過(guò)測(cè)定大河烏豬和大河豬肉質(zhì)指標(biāo)的結(jié)果表明，大河烏豬較大河豬的胴體品質(zhì)和產(chǎn)肉性能均有較大幅度的改善，生產(chǎn)性能有較大幅度的提高，且有效地保持了大河豬在肉質(zhì)性狀上的優(yōu)勢(shì)，并在肉質(zhì)評(píng)分上基本都優(yōu)于大河豬，大河烏豬的IMF水平雖略有下降，但仍保持較高水平。此外，兩品種在氨基酸和脂肪酸組成上差異不顯著，也說(shuō)明大河烏豬的選育過(guò)程中保持了大河豬在脂肪和蛋白質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)上的優(yōu)良性，大河烏豬是一種具有重要實(shí)際應(yīng)用價(jià)值與研究?jī)r(jià)值的品種。因此，對(duì)其脂代謝相關(guān)功能的研究具有極為重要的意義。

STARD4（類(lèi)固醇合成相關(guān)脂轉(zhuǎn)移4）基因是進(jìn)化上保守的START基因家族的成員，是一種可溶性的甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與膽固醇感知和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。STARD4被廣泛表達(dá)，并已被證明其在細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體和細(xì)胞器之間轉(zhuǎn)移膽固醇[4]。非特異性固醇轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中，STARD4是在質(zhì)膜和ERC（Endocyticrecycling compartment，內(nèi)吞循環(huán)體）之間的固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中占很大比例[5]。人類(lèi)STARD4基因的結(jié)構(gòu)顯示其具有一個(gè)保守的α-螺旋/β-GRIP折疊，其中包含一個(gè)很深的疏水口袋，用作疏水口袋蓋的Ω1-環(huán)具有封閉構(gòu)象。封閉形式的甾醇結(jié)合腔的形狀不能互補(bǔ)用來(lái)容納膽固醇，這表明Ω1-環(huán)的構(gòu)象變化對(duì)于甾醇結(jié)合是必不可少的。人類(lèi)STARD4基因具有脂質(zhì)體間的膽固醇轉(zhuǎn)移活性，Ω1-環(huán)和疏水壁的突變使該轉(zhuǎn)移活性喪失[6]。Iaea等[5]的研究表明可溶性膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STARD4占總膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)量的25%，占質(zhì)膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間非囊性膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)量的33%。膽固醇的非囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，特別是STARD4，在質(zhì)膜和ERC之間的甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)中占有很大比例。Soccio等[7]利用cDNA微陣列，發(fā)現(xiàn)STARD4基因在喂食高膽固醇飲食的小鼠肝臟中的表達(dá)降低了2倍以上。Northern印跡分析（RNA印漬術(shù)）表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫對(duì)STARD4的誘導(dǎo)僅限于早期階段。熒光素酶報(bào)告基因分析表明，STARD4的誘導(dǎo)依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子ATF6及其啟動(dòng)子中的類(lèi)erse元件（ER stress元件，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相應(yīng)元件）[8]。Garbarino等[9]也發(fā)現(xiàn)了STARD4表達(dá)的減少會(huì)導(dǎo)致膽固醇滯留在質(zhì)膜上，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的膽固醇減少，ACAT（Acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶）合成的膽固醇酯減少。Mesmin等[10]為了分析STARD4的作用機(jī)制，比較了STARD4介導(dǎo)的甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)和簡(jiǎn)單的膽固醇載體MCD（Methyl-Beta-Cyclodextrin，甲基-β-環(huán)糊精）介導(dǎo)的甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)。STARD4和胞內(nèi)MCD的作用相似，它們?cè)黾恿绥薮枷駿RC和ER（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）的轉(zhuǎn)移率。其結(jié)果提示，STARD4介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)是膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制的重要組成部分。David等[4]通過(guò)敲除膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STARD4，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體發(fā)生了很大的變化。STARD4-KD細(xì)胞的mRNA譜也有較大變化。結(jié)果表明細(xì)胞膽固醇增加，包括晚期的內(nèi)小體。這些結(jié)果也表明了STARD4在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。此外，還有證據(jù)表明STARD4的表達(dá)增加還能促進(jìn)膽汁酸的合成，綜上所述STARD4是一種高度調(diào)控的、非囊泡性的、定向的細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體，在維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。

1 研究的目的與意義

關(guān)于STARD4基因的相關(guān)研究都表明其在脂肪代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)或分解過(guò)程中起到一定作用，但目前在國(guó)內(nèi)還很少見(jiàn)到關(guān)于STARD4基因與脂代謝相關(guān)功能的研究。本文對(duì)大河烏豬基因進(jìn)行分子鑒定、組織表達(dá)、多態(tài)性分析，以為后續(xù)對(duì)STARD4基因在對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)，構(gòu)建人類(lèi)疾病模型等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料與數(shù)據(jù)分析

2020年5月，隨機(jī)采取云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院自有試驗(yàn)動(dòng)物中心200頭成年大河烏豬的肺臟組織、脂肪組織、脾臟組織、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織、小腸組織和肌肉組織。采用GENSCAN工具對(duì)cDNA序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心生物大分子序列比對(duì)搜索工具對(duì)序列的同源性進(jìn)行分析，利用CLUSTAL OMEGA對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。對(duì)STARD4基因編碼的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行預(yù)測(cè)采用COMPUTER PI和MW TOOL工具進(jìn)行。組織表達(dá)特異性分析使用Applied Biosystems 7900HT SDS來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)開(kāi)放閱讀框的分析使用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心中的開(kāi)放閱讀框查詢(xún)軟件進(jìn)行。豬STARD4基因的組織表達(dá)分析采用qRT-PCR的方法進(jìn)行。

2.2 試驗(yàn)方法

分離大河烏豬STARD4基因的全長(zhǎng)cDNA。引物使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行并設(shè)計(jì)5'-RACE和3'-RACE引物。STARD4基因5'-RACE和3'-RACE引物序列如表1所示。

表1 STARD4基因5'-和3'-RACE引物

RACE-PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min條件下進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s和72 ℃3 min條件下進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)直至本次反應(yīng)程序終止。對(duì)PCR引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)及鑒定使用凝膠電泳。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)外，剩余產(chǎn)物用于0.8%瓊脂糖凝膠電泳并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)特異性條帶切膠回收。最后進(jìn)行測(cè)序。

3 結(jié)果與分析

3.1 大河烏豬STARD4基因全長(zhǎng)cDNA序列的分子克隆

經(jīng)過(guò)5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增，得到了一條長(zhǎng)度為895 bp和一條長(zhǎng)度為871 bp的片段，并將這些產(chǎn)物分別插于T-載體進(jìn)行克隆測(cè)序，從而得到一個(gè)1 164 bp的全長(zhǎng)cDNA（圖1）。

3.2 大河烏豬STARD4基因的序列分析

通過(guò)BLAST比對(duì)大河烏豬STARD4基因cDNA核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，該基因與已知的豬的任何基因都不同源，將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（Accession number：FJ436384）。利用GENSCAN軟件對(duì)該1 164 bp cDNA序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼209個(gè)氨基酸的完全單基因該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）和分子量（Mw）的計(jì)算采用Compute pI/Mw Tool軟件，計(jì)算出該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5.37，分子量為23 798.14 Da。

進(jìn)一步比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)與太平洋短吻海豚（Lagenorhynchus obliquidens）（accession number：XM_027100170）的STARD4蛋白具有91.3%的同源性、雙峰駝（Camelus bactrianus）（accession number：XP_010969783）的STARD4蛋白具有96.2%的同源性、羊駝（Vicugna pacos）（accession number：XP_015094376）的STARD4蛋白具有95.2%的同源性、美洲獅（Puma concolor）（accession number：XP_025779258）的STARD4蛋白具有93.8%的同源性、虎鯨（Orcinus orca）（accession number：XP_005901130）的STARD4蛋白具有95.2%的同源性。

該蛋白具有START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/CoxG/CalC（SRPBCC）ligand-binding domain superfamily結(jié)構(gòu)域。

在以上STARD4蛋白質(zhì)比對(duì)的結(jié)果基礎(chǔ)上，通過(guò)EMBL-EBI（https://www.ebi.ac.uk）中的Clustal Omega工具（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）構(gòu)建了STARD4基因進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2。

基因進(jìn)化分析表明了大河烏豬的STARD4基因與虎鯨（Orcinus orca）的STARD4基因遺傳關(guān)系較近。

3.3 大河烏豬STARD4基因的基因變異分析

在豬蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)大河烏豬STARD4蛋白還存在1個(gè)變異體Isoform X1（accession number：XP_020932818.1），與豬STARD4蛋白具有99%的高度相似性。

進(jìn)一步在豬基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析中發(fā)現(xiàn)，大河烏豬STARD4蛋白質(zhì)編碼區(qū)存在2個(gè)突變位點(diǎn)（表2）。

表2 大河烏豬STARD4基因變異分析

3.4 大河烏豬STARD4基因的組織表達(dá)譜分析

組織表達(dá)譜分析表明STARD4在脂肪、肝臟、肌肉、脾臟、腎臟、小腸中高度表達(dá)，在心臟中中等表達(dá)（圖3）。

4 討論

豬在我國(guó)養(yǎng)殖生產(chǎn)中占有重要地位且其為一種重要的試驗(yàn)動(dòng)物，而STARD4基因又與脂肪代謝和人類(lèi)疾病緊密相關(guān)。目前在其他物種上，對(duì)STARD4基因的研究雖有一些報(bào)道，但對(duì)于豬STARD4基因的克隆以及對(duì)其功能的研究還鮮少報(bào)道。本試驗(yàn)首次克隆國(guó)內(nèi)大河烏豬STARD4基因的cDNA序列全長(zhǎng)。為后續(xù)以豬為動(dòng)物模型研究STARD4基因相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。相關(guān)研究表明，STARD4能增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的形成，并受細(xì)胞內(nèi)固醇水平的調(diào)控。當(dāng)STARD4過(guò)表達(dá)時(shí)，固醇向內(nèi)吞循環(huán)體（ERC）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的運(yùn)輸增加。STARD4介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)是膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制的重要組成部分[12]。STARD4表達(dá)的減少會(huì)導(dǎo)致膽固醇滯留在質(zhì)膜上，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的膽固醇減少，ACAT合成的膽固醇酯減少[10]。在后續(xù)的研究中我們將對(duì)豬STARD4基因的這些信號(hào)通路以及作用機(jī)制進(jìn)行研究，尋找與STARD4基因具有相同突變基因型的個(gè)體作為模式動(dòng)物，對(duì)STARD4基因與脂代謝疾病之間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步深入的研究。

5 結(jié)論

大河烏豬STARD4基因完整全長(zhǎng)cDNA序列為1 164 bp，編碼209個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.37，分子量為23 798.14 Da。豬STARD4基因編碼的蛋白與太平洋短吻海豚、雙峰駝、羊駝、美洲獅、虎鯨的STARD4蛋白分別具有91.3%、96.2%、95.2%、93.8%、95.2%的高度同源性。該蛋白具有START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/Cox G/CalC（SRPBCC）ligand-binding domain superfamily結(jié)構(gòu)域和一個(gè)變異體。其基因編碼區(qū)存在2個(gè)突變位點(diǎn)。該基因與虎鯨的STARD4基因有著較近的親緣關(guān)系。大河烏豬STARD4基因在肝臟、肌肉、脾臟、腎臟、小腸、脂肪和肺高度表達(dá)，在心臟中中等表達(dá)。