叢枝菌根真菌減少污染土壤Cd淋溶流失的效應(yīng)研究

張金秀，蘇琳，蔣明，李明銳，王燦，何永美，陳建軍，湛方棟*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201；2.昆明市生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院，昆明 650032；3.中國冶金地質(zhì)總局昆明地質(zhì)勘查院，昆明 650203）

由于金屬礦產(chǎn)開采冶煉、污水灌溉和污泥施用等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)，農(nóng)田土壤重金屬污染日益嚴(yán)重，成為全球重大環(huán)境問題之一。鎘（Cd）是農(nóng)田土壤常見的污染元素，具有較強(qiáng)的活性與遷移能力，易隨水體淋溶流失。在灌溉、降雨等情形下，污染農(nóng)田土壤Cd離子發(fā)生淋溶流失，遷移到周邊水體中，進(jìn)而導(dǎo)致流域水體Cd污染。因此，污染土壤的Cd淋溶流失問題引起了普遍關(guān)注。

叢枝 菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中重要的微生物，即使在重金屬嚴(yán)重污染的土壤中，AMF也普遍存在。AMF侵染寄主植物根系后，根外菌絲在土壤中分枝延伸形成龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)，其生態(tài)學(xué)作用引起人們的廣泛關(guān)注。AMF菌絲在土壤中能迅速分解轉(zhuǎn)化，顯著改變土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，對(duì)土壤Cd等元素的環(huán)境行為與生態(tài)效應(yīng)產(chǎn)生重大影響。然而，這方面的研究主要集中在AMF增強(qiáng)植物對(duì)Cd的耐受性、影響Cd在土壤-植物系統(tǒng)中遷移上，但對(duì)AMF影響污染土壤Cd的淋溶流失及其作用機(jī)制的了解很有限。

土壤團(tuán)聚體組成會(huì)顯著影響污染土壤Cd的淋溶流失。其中，大團(tuán)聚體是由微團(tuán)聚體黏合而成的一類比表面積大、多孔的土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，其黏附力遠(yuǎn)大于環(huán)繞在周圍的微小團(tuán)粒。大團(tuán)聚體對(duì)土壤養(yǎng)分和水分具有較好的固持作用，且對(duì)Cd離子具有較強(qiáng)的吸附作用，有助于減少污染土壤Cd的淋溶流失。值得注意的是，AMF能夠通過菌絲纏繞、分泌球囊霉素相關(guān)蛋白（Glomalin related soil protein，GRSP）等作用促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成。因此，AMF可能會(huì)通過影響污染土壤的團(tuán)粒組成，改變土壤Cd的淋溶流失，這為研究AMF影響污染土壤Cd淋溶流失的可能機(jī)制提供了思路。

本文以云南典型的鉛鋅礦區(qū)周邊Cd污染農(nóng)田土壤為供試基質(zhì)，制備高度為40 cm的土柱，以玉米為寄主植物，設(shè)置接種和不接種AMF處理，開展土壤淋溶試驗(yàn)，研究AMF對(duì)玉米生長、Cd吸收、土壤團(tuán)粒組成、壤中流Cd濃度與Cd淋溶流失的影響，分析土壤團(tuán)粒組成與壤中流Cd濃度、Cd淋溶流失間的關(guān)系，以闡釋AMF影響污染土壤Cd淋溶流失的效應(yīng)及其初步機(jī)制，豐富對(duì)污染土壤中AMF的生態(tài)功能及其作用機(jī)制等方面的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米（L）為會(huì)單4號(hào)，購于云南省昆明市小板橋種子市場，所選種子籽粒飽滿且大小一致。AMF供試菌種為摩西斗管囊霉（），其菌種保藏號(hào)為BGC YN05，1511C0001BGCAM0013，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供，主要由土壤顆粒、孢子和細(xì)根段組成。

供試土壤采自云南省蘭坪鉛鋅礦（26°22'30.0″N，99°22'27.6″E）周邊污染農(nóng)田，其基本理化性質(zhì)如下：pH為6.11，有機(jī)質(zhì)為32.12 g·kg，Cd和Pb全量分別為4.27 mg·kg和68.29 mg·kg，全氮和全磷含量分別為2.87 g·kg和1.58 g·kg，堿解氮和速效磷含量分別為72.54 mg·kg和58.03 mg·kg。土壤采回后，經(jīng)自然風(fēng)干，剔除雜物，搗碎研磨后過2 mm尼龍篩混勻，將土壤放入蒸汽高壓滅菌鍋，121℃高溫滅菌120 min后，常溫條件放置3 d待用。

1.2 試驗(yàn)處理

2018年6 月，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)大棚內(nèi)開始土柱試驗(yàn)。試驗(yàn)土柱為直徑110 mm、高45 cm的聚氯乙烯（PVC）管；采用滅菌土壤裝填土柱，每個(gè)土柱土壤裝填量為4.0 kg（圖1）。土柱底端封閉，設(shè)置1個(gè)出水閥，用于收集淋溶液；在土柱的10、20 cm和30 cm深度處設(shè)置壤中流取樣點(diǎn)，用于采集壤中流樣品。

圖1 試驗(yàn)裝置與取樣位置示意圖Figure 1 Schematic diagram of test device

玉米種子首先在1%次氯酸鈉（NaClO）溶液中浸泡1 min，然后移入75%的乙醇溶液中浸泡3 min，取出后用無菌水沖洗3次，完成玉米種子的表面消毒。將玉米種子置于墊有浸濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，25℃下恒溫培養(yǎng)4 d，待種子萌發(fā)冒白2 cm左右，挑選無污染且生長一致的萌發(fā)種子進(jìn)行種植。

試驗(yàn)設(shè)不接種AMF（CK）和接種AMF（AMF）2組處理，每組處理6個(gè)平行。先在土柱中裝入3.5 kg滅菌土，AMF處理將40 g AMF菌劑平鋪在土柱中，CK處理則加入40 g AMF滅活菌劑；種植2粒玉米種子，再均勻加入500 g滅菌土，以覆蓋玉米種子（圖1）。土柱試驗(yàn)過程中不施用化肥和農(nóng)藥，自然光照，溫室溫度為14～29℃；期間根據(jù)土柱土壤水分狀況澆灌去離子水20～30 mL，保持土壤濕潤。

1.3 樣品采集

在玉米種植第45天和第50天，進(jìn)行人工灌溉，開展淋溶試驗(yàn)。每次灌溉量為2.0 L，每15 min澆灌去離子水500 mL，共澆灌4次，相當(dāng)于33.3 mL·min的降雨強(qiáng)度。

在澆灌開始后，打開土柱底部的出水閥，收集土柱產(chǎn)生的淋溶液，直至出水閥不產(chǎn)生水滴，使用容量筒測量淋溶液體積。澆灌30 min后，采用0.25μm陶瓷濾管（RHIZON MOM 19.21.21F）負(fù)壓抽取深度為10、20 cm和30 cm的土柱土壤溶液50 mL。

第2次土柱淋溶試驗(yàn)后，采集玉米植株與根際土壤樣品。將玉米整株取出，抖去根部附著的疏松土壤，采集與根系緊密結(jié)合的根際土壤（厚度約為1 mm），室內(nèi)自然風(fēng)干、研磨后備用。將玉米植株分為地上部（莖葉）和地下部（根系），分別用無菌水漂洗干凈、晾干；除選取少量細(xì)根用于AMF侵染率指標(biāo)測定外，玉米植株于105℃殺青30 min，再經(jīng)75℃烘干72 h至恒質(zhì)量，獲得植株干質(zhì)量，碾磨粉碎備用。

1.4 測定方法

將根系鮮樣剪成1 cm左右的根段，堿解離、藍(lán)墨水染色后，采用曲利苯藍(lán)染色改良法測定AMF的侵染率。采用蔗糖離心法測定AMF孢子數(shù)：稱取10.0 g土樣，反復(fù)沖洗過0.25 mm篩，將殘留物轉(zhuǎn)移至100 mL的離心管中，3 000 r·min離心10 min，去掉上清液后加入50%蔗糖溶液，充分搖勻，3 000 r·min離心10 min得到上清液，用濾紙過濾上清液，在立體顯微鏡下觀察濾紙上AMF孢子的數(shù)量。

稱取1.0 g風(fēng)干土樣，在0.11 MPa、121℃條件下，采用20 mmol·L檸檬酸緩沖液（pH 7.0）提取30 min，得到易提取球囊霉素相關(guān)蛋白（Easy extractive glomalin related soil protein，EE-GRSP）的待測液；50 mmol·L檸檬酸鈉緩沖液（pH 8.0）提取60 min，連續(xù)提取3次，得到總球囊霉素相關(guān)蛋白（Total glomalin related soil protein，T-GRSP）的待測液。采用Braford法測定土壤EE-GRSP和T-GRSP的含量。

稱取過2 mm篩的風(fēng)干土樣30 g，放置于土壤團(tuán)粒分析儀中，套篩孔徑依次為0.85、0.25 mm和0.075 mm，采用濕篩法分離不同粒徑的土壤團(tuán)聚體，于105℃下烘至恒質(zhì)量，分別稱量，獲得粒徑（）＞0.85、0.25～0.85、0.075～0.25 mm和＜0.075 mm的土壤團(tuán)聚體含量。

稱取1.0 g土樣，采用0.1 mol·LHCl浸提-火焰原子分光光度法測定土壤有效態(tài)Cd的含量。稱取0.5 g植株干樣，采用HSO-HO消解-凱氏定氮法-釩鉬黃比色法測定植株全氮和全磷的含量。稱取0.1 g植株干樣，采用HNO-HClO消解-火焰原子吸收分光光度法測定植株的Cd含量。

吸取10 mL壤中流或20 mL淋溶液，采用HNO-HO消解，石墨爐原子吸收法測定溶液的Cd濃度。將淋溶液Cd濃度乘以其體積，獲得土柱Cd的淋溶流失量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；用LSD法檢驗(yàn)處理間差異顯著性，＜0.05為顯著，＜0.01為極顯著；采用Person法分析相關(guān)性，用OriginPro 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米根系A(chǔ)MF侵染特征

AMF在玉米根系中的結(jié)構(gòu)見圖2。經(jīng)檢測，接種AMF土壤的根系侵染率為25%，菌絲密度為28.36 cm·g，孢子數(shù)為18.82個(gè)·g。

圖2 AMF在玉米根系中的結(jié)構(gòu)Figure 2 Typical structures of AMF in maize roots

由圖3可知，與CK相比，AMF處理0～10 cm和10～20 cm土層土壤EE-GRSP含量顯著上升，分別增加24%和33%，0～10、10～20、20～30 cm和30～40 cm土層土壤T-GRSP含量分別顯著增加44%、36%、16%和11%。綜上可知，重金屬脅迫下接種AMF能不同程度增加0～40 cm不同土層土壤中EE-GRSP和TGRSP的含量。

圖3 接種AMF對(duì)土壤球囊霉素相關(guān)蛋白含量的影響Figure 3 Effects of AMF on contents of GRSP in soil

2.2 接種AMF對(duì)土壤團(tuán)聚體粒徑分布的影響

由圖4可知，與CK相比，AMF處理0～10、10～20 cm和30～40 cm土層土壤中＞0.85 mm團(tuán)聚體含量分別顯著增加28%、46%和13%，0～10、20～30 cm和30～40 cm土層土壤中0.85 mm＞＞0.25 mm團(tuán)聚體含量分別顯著增加10%、22%和55%。而與CK相比，AMF處理0～40 cm土層土壤中0.25 mm＞＞0.075 mm團(tuán)聚體含量均顯著降低，降幅為10%～12%，0～10 cm和10～20 cm土層土壤中＜0.075 mm團(tuán)聚體含量分別顯著降低13%和16%。綜上可知，重金屬脅迫下土壤接種AMF能增加土壤＞0.25 mm團(tuán)聚體含量，降低＜0.25 mm團(tuán)聚體含量。

圖4 接種AMF對(duì)不同土層土壤不同粒徑團(tuán)聚體含量的影響Figure 4 Effects of AMF on aggregate contents in soil

2.3 接種AMF對(duì)土壤有效態(tài)Cd含量和植物Cd吸收量的影響

由圖5可知，與CK相比，AMF處理0～10、10～20 cm和30～40 cm土層土壤中有效態(tài)Cd含量分別顯著降低26%、16%和27%，表明接種AMF能不同程度降低土壤不同土層的有效態(tài)Cd含量。

圖5 接種AMF對(duì)不同土層土壤有效態(tài)Cd含量的影響Figure 5 Effects of AMF on available Cd contents in soil

由表1可知，與CK相比，AMF處理玉米地上部生物量顯著增加36%，地上部和地下部Cd含量分別顯著降低45%和40%，地上部和地下部Cd吸收量分別顯著降低25%和31%。

表1 接種AMF對(duì)玉米Cd含量和累積量的影響Table 1 Effects of AMF inoculation on biomass，Cd content and accumulation in maize

2.4 接種AMF對(duì)壤中流Cd含量的影響

由圖6可知，與CK相比，第一次淋溶試驗(yàn)后，AMF處理0～10 cm和20～30 cm土層的壤中流Cd含量顯著降低20%和23%，第二次淋溶試驗(yàn)后，AMF處理10～20 cm和20～30 cm土層的壤中流Cd含量顯著降低22%和14%。表明重金屬污染脅迫下土壤接種AMF能減少不同土層壤中流的Cd含量。

圖6 接種AMF對(duì)壤中流Cd含量的影響Figure 6 Effects of AMF on Cd concentrations in interflow

2.5 接種AMF對(duì)Cd淋溶流失的影響

由表2可知，與CK相比，第一次淋溶試驗(yàn)后，AMF處理對(duì)淋溶液Cd含量和Cd流失量均沒有顯著影響；第二次淋溶試驗(yàn)后，AMF處理下淋溶液Cd含量和Cd流失量分別顯著降低30%和34%；第二次淋溶試驗(yàn)后，AMF處理下淋溶流失總量降低29%。表明接種AMF能減少淋溶液中有效態(tài)Cd含量與流失量。

表2 接種AMF對(duì)土壤Cd含量和流失量的影響Table 2 Effects of AMF inoculation on Cd content and loss in soil

2.6 相關(guān)性分析

由表3可知，＞0.85 mm的團(tuán)聚體含量與壤中流Cd含量呈顯著負(fù)相關(guān)；0.85 mm＞＞0.25 mm的團(tuán)聚體含量與T-GRSP呈顯著正相關(guān)，與壤中流Cd含量和Cd淋溶流失量呈極顯著負(fù)相關(guān)；0.25 mm＞＞0.075 mm的團(tuán)聚體含量與Cd淋溶流失量呈顯著正相關(guān)；＜0.075 mm的團(tuán)聚體含量與T-GRSP和EE-GRSP含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與Cd淋溶流失量呈顯著正相關(guān)。土壤有效態(tài)Cd含量與壤中流Cd含量和Cd淋溶流失量分別呈極顯著與顯著正相關(guān)。

表3 GRSP、淋溶液Cd含量、Cd流失量與土壤水穩(wěn)態(tài)團(tuán)聚體、有效態(tài)Cd含量的相關(guān)性Table 3 Correlations between contents of available Cd and GRSP，Cd concentration in interflow and leachate with contents of aggregate and available Cd in soil

3 討論

在重金屬脅迫下，與CK相比，接種AMF土壤的T-GRSP和EE-GRSP含量顯著增加，土壤有效態(tài)Cd含量顯著降低。GRSP是AMF代謝分泌的一類糖蛋白，能與土壤中重金屬結(jié)合，改變重金屬的生物有效性，GRSP含有的芳香烴、羥基等不穩(wěn)定活性官能團(tuán)，能夠通過離子交換吸附-配合-共沉淀作用，促使土壤中的重金屬由離子態(tài)向殘?jiān)鼞B(tài)轉(zhuǎn)變。有研究表明，GRSP能固定土壤中Cd、Pb等重金屬離子，且GRSP與土壤有效態(tài)Cd、Pb含量呈負(fù)相關(guān)，其結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)中，在重金屬脅迫下，接種AMF后，0～40 cm土層的＞0.25 mm團(tuán)聚體含量顯著高于CK。AMF侵染寄主植物后形成的發(fā)達(dá)的根外菌絲與其分泌物GRSP的機(jī)械纏繞，聯(lián)合腐植酸類物質(zhì)的超強(qiáng)黏合作用將土壤顆粒纏繞黏合形成土壤團(tuán)聚體。菌絲、GRSP以及腐植酸在團(tuán)聚體穩(wěn)定性中扮演著重要的角色，其能將小土壤顆粒黏成＜0.25 mm的微團(tuán)聚體，進(jìn)而形成水穩(wěn)態(tài)團(tuán)聚體（＞0.25 mm）。有學(xué)者研究不同真菌對(duì)土壤結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，土壤接種AMF后穩(wěn)定性團(tuán)聚體含量遠(yuǎn)高于微團(tuán)聚體含量；有學(xué)者研究接種不同真菌對(duì)水穩(wěn)性大團(tuán)聚體形成的作用得出，接種真菌的土壤形成水穩(wěn)性大團(tuán)聚體的含量顯著高于未接種土壤。但目前對(duì)于團(tuán)聚體的形成因素中，AMF根外菌絲、GRSP以及腐植酸類物質(zhì)哪種因素占主導(dǎo)地位或者為主要因素還未有準(zhǔn)確結(jié)果，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明，與CK相比，接種AMF后，0～40 cm土層的＞0.25 mm團(tuán)聚體含量顯著增加，0～40 cm土層土壤有效態(tài)Cd含量顯著下降。這可能是由于不同粒徑團(tuán)聚體對(duì)土壤中重金屬吸附固定作用有明顯的差異，此外，不同粒徑土壤團(tuán)聚體中AMF菌絲、GRSP以及腐植酸類物質(zhì)含量不同以及團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)也存在差異。接種AMF能改善土壤團(tuán)聚體的水穩(wěn)定性，吸附固定土壤有效態(tài)重金屬。團(tuán)聚體是農(nóng)田土壤中重金屬吸持的關(guān)鍵因素，0.2～2 mm粒徑的團(tuán)聚體能夠集聚大量的植物根系以及腐植酸類物質(zhì)等，對(duì)重金屬有很強(qiáng)的吸附固持能力。

土壤中游離態(tài)Cd離子極易在土壤中遷移流動(dòng)，在灌溉、降雨、降雪等淋溶作用下，Cd離子下滲到地下水，或擴(kuò)散到流域出水口，影響地下水水質(zhì)，擴(kuò)大農(nóng)田土壤Cd污染面積。降低Cd的移動(dòng)性，將Cd固定在土壤中以減少Cd的流失量是解決Cd流失的關(guān)鍵性因素。GRSP是菌根共生體分泌物，含有大量土壤有機(jī)質(zhì)、多環(huán)芳烴以及陰離子基團(tuán)，其特殊的組成結(jié)構(gòu)能改變土壤中有效態(tài)重金屬的生物有效性，將游離態(tài)金屬離子轉(zhuǎn)變?yōu)闅堅(jiān)鼞B(tài)金屬沉淀物。大量相關(guān)研究表明，重金屬脅迫下，接種AMF后能降低土壤環(huán)境中重金屬的生物有效性，其分泌的GRSP能夠固定土壤中的Cd；當(dāng)土壤中Cd含量較高時(shí)，GRSP對(duì)Cd的固定量也較高。本研究結(jié)果表明，重金屬污染脅迫下，接種AMF土壤的GRSP濃度顯著上升，不同土層土壤有效態(tài)Cd含量顯著降低。

不同粒徑的土壤團(tuán)聚體對(duì)土壤中Cd吸收率和淋溶流失的影響存在差異。＞0.25 mm的水穩(wěn)性團(tuán)聚體具有多孔性、比表面積大等特性，且富含大量的腐植酸類物質(zhì)，能夠增加對(duì)Cd離子的吸附-絡(luò)合-螯合等作用，從而改變重金屬Cd在土壤中的存在形態(tài)，將游離態(tài)Cd固定在土壤中，減少Cd的淋溶流失。有研究表明，＞0.25 mm的水穩(wěn)態(tài)團(tuán)聚體吸附有效態(tài)重金屬的效率顯著高于＜0.25 mm的微團(tuán)聚體，能使淋溶液中的有效態(tài)重金屬含量降低，重金屬流失量減少。本研究結(jié)果顯示，0～40 cm土層水穩(wěn)態(tài)團(tuán)聚體含量顯著增加，兩次淋溶0～30 cm土層壤中流有效態(tài)Cd含量顯著降低，第二次淋溶的淋溶液中有效態(tài)Cd含量和流失量均顯著降低，且Cd淋溶流失量與＞0.25的團(tuán)聚體含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與＜0.25 mm的團(tuán)聚體含量和土壤有效態(tài)Cd含量呈顯著正相關(guān)。綜上可知，重金屬污染脅迫下，接種AMF能增加土壤水穩(wěn)態(tài)團(tuán)聚體含量，降低淋溶液中有效態(tài)Cd濃度和流失量。

4 結(jié)論

（1）重金屬污染脅迫下，接種叢枝菌根真菌能夠降低土壤中有效態(tài)Cd含量，從而減少土壤有效態(tài)Cd在玉米體內(nèi)的富集，緩解重金屬對(duì)植物的毒害，促進(jìn)植物生長。

（2）接種叢枝菌根真菌能夠強(qiáng)化土壤對(duì)壤中流Cd的固持效應(yīng)，降低壤中流有效態(tài)Cd濃度，從而減少灌溉等淋溶作用下土壤Cd的流失量和擴(kuò)散效應(yīng)。