瑪卡復(fù)方提取物對(duì)游泳力竭小鼠抗疲勞的影響

楊采霞,王松濤，黃張君，李陽(yáng)，牛曼思，沈才洪▲，國(guó)錦琳▲

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 瀘州老窖養(yǎng)生酒研究中心，四川 成都 611137； 2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州 646000)

疲勞是指機(jī)體在生理過(guò)程中不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)和工作的輸出。重復(fù)和持續(xù)的體力運(yùn)動(dòng)很容易導(dǎo)致疲勞，嚴(yán)重影響人類健康[1]。瑪卡(LepidiummeyeniiWalp)是一種生長(zhǎng)于南美秘魯?shù)氖只篇?dú)行菜屬草本植株，是一種享譽(yù)全球的健康食品，具有抗疲勞功效[2]。安第斯山脈中部人群一直運(yùn)用瑪卡療養(yǎng)身體，至今未發(fā)現(xiàn)其有任何毒性報(bào)道[3]。目前瑪卡的藥理活性研究主要集中在單味瑪卡提取物抗疲勞方面[4-6]，沒(méi)有瑪卡復(fù)方作用的相關(guān)研究。本項(xiàng)目在國(guó)醫(yī)大師郭子光指導(dǎo)下以瑪卡配伍枸杞子、覆盆子、無(wú)花果、白扁豆四味藥食同源中藥組成了瑪卡抗疲勞復(fù)方。研究表明，運(yùn)動(dòng)時(shí)主要的供能物質(zhì)是糖，而糖原是轉(zhuǎn)化產(chǎn)生大量糖的基礎(chǔ)，集體中大量的糖原儲(chǔ)存能有效地抵抗大量消耗性運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的疲勞[7-8]。在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體處于缺氧的狀態(tài)，肌肉細(xì)胞通過(guò)無(wú)氧糖酵解供能，但伴隨著產(chǎn)生的大量乳酸會(huì)使得細(xì)胞中的游離H+增加，使肌肉細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡，肌肉運(yùn)動(dòng)能力下降，誘導(dǎo)疲勞感[9-10]；在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體糖和脂質(zhì)類物質(zhì)耗竭，機(jī)體會(huì)動(dòng)員蛋白質(zhì)與氨基酸參與分解代謝，產(chǎn)生尿素氮代謝產(chǎn)物，血中尿素氮水平可反映機(jī)體疲勞程度[11]?；诖?，本研究選用小鼠負(fù)重游泳經(jīng)典模型[12]，測(cè)定小鼠游泳力竭時(shí)間以及血液中乳酸、尿素氮水平等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠抗疲勞效果，同時(shí)評(píng)價(jià)瑪卡復(fù)方水提物對(duì)小鼠主要代謝器官的影響。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

瑪卡、枸杞子、覆盆子、無(wú)花果和白扁豆均為上海天源植物制品有限公司按照《中華人民共和國(guó)藥典》和新食品原料要求從新荷花中藥飲片股份有限公司采購(gòu)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)錦琳教授鑒定為十字花科獨(dú)行菜屬植物瑪卡(LepidiummeyeniiWalp)的干燥根莖、茄科植物枸杞屬植物寧夏枸杞(LyciiFructus)的干燥成熟果實(shí)枸杞子、薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子(RubiFructus)的干燥果實(shí)覆盆子、?？崎艑僦参餆o(wú)花果(Ficuscarica Linn)的干燥成熟果實(shí)無(wú)花果、豆科植物扁豆屬植物扁豆(LablabSemenAlbum)的干燥成熟種子白扁豆。用1∶10沸水提取3次，減壓濃縮至比重1.30-1.50，噴霧干燥，1 g最終提取物產(chǎn)品相當(dāng)于15 g飲片。

1.2 動(dòng)物

選用昆明種雄性小鼠(SPF級(jí)),窩齡21 d，體質(zhì)量(12±2)g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030]。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于正式實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑和儀器

本實(shí)驗(yàn)中所用的主要試劑和儀器的具體信息在表1中列舉，其他未列出的試劑均為分析純或者更高純度。

表1 試劑和儀器信息

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和劑量設(shè)計(jì)

將120只小鼠隨機(jī)分成3個(gè)試驗(yàn)組(即A、B、C試驗(yàn)組)，每個(gè)試驗(yàn)組分別設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組和3個(gè)用藥組，每組10只小鼠[13]。按照瑪卡復(fù)方提取物推薦的人體用藥劑量(3.00 g/60 kg)換算小鼠的灌胃給藥劑量(即人體的5倍、10倍、20倍)，設(shè)置瑪卡復(fù)方提取物低、中、高用藥組(瑪卡復(fù)方提取物0.25 g/kg、0.50 g/kg、1.00 g/kg)。實(shí)驗(yàn)中所有的藥物均采取以生理鹽水溶解后按照每天的用量當(dāng)天制備，每只小鼠每天灌胃給藥體積0.2 mL/10 g，持續(xù)給予30 d，空白組小鼠給予相同體積的生理鹽水。

2.2 小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)測(cè)定

小鼠在實(shí)驗(yàn)期間，可以自由獲得飲食和飲水，實(shí)驗(yàn)第1天對(duì)小鼠進(jìn)行體質(zhì)量測(cè)定后，以后每3 d對(duì)小鼠進(jìn)行一次體質(zhì)量測(cè)定。最后，將30 d內(nèi)獲得的小鼠體質(zhì)量以10 d為時(shí)間段整理實(shí)驗(yàn)期間瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響[14]。

2.3 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

A試驗(yàn)組在最后一次灌胃給藥30 min后，測(cè)定小鼠體質(zhì)量，根據(jù)其體質(zhì)量換算鉛皮質(zhì)量(鉛皮質(zhì)量=體質(zhì)量×5%)，在每只小鼠距離尾根部1 cm處系上鉛皮，放入水深30 cm，水溫(25±1)℃的游泳箱內(nèi)，記錄小鼠自放入游泳開(kāi)始至死亡的時(shí)間[15]，期間，若有小鼠處于不動(dòng)狀態(tài)，可以用木棍攪動(dòng)水面，保證小鼠運(yùn)動(dòng)。

2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

B試驗(yàn)組，末次給藥30 min后，將各組小鼠分別放入設(shè)置好水溫為(30±1)℃，水深為30 cm的水中自由游泳90 min，游泳結(jié)束后迅速撈起小鼠并用干毛巾加速小鼠干燥后放于干凈的鼠籠內(nèi)休息60 min后，摘眼球采血，所有血液樣本放置于4℃冰箱過(guò)夜，以1 000 g離心10 min分離得到血清，測(cè)定血清中的BUN、BLA。C試驗(yàn)組，末次給藥30 min后，在靜息狀況下收集小鼠的部分肝臟、腎臟和小腿后肢肌肉，-80 ℃冰箱貯存，檢測(cè)糖原水平[16]。

2.5 肝腎組織病理學(xué)檢查

C試驗(yàn)組收集的部分肝臟組織和腎臟組織，迅速用4℃生理鹽水洗凈后，固定在4%多聚甲醛溶液中[17]。固定好的組織按照HE染色制片要求制片并采用Pannoramic250數(shù)字切片掃描儀對(duì)切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部組織，隨后選擇要觀察的區(qū)域100倍下觀察具體組織結(jié)構(gòu)，采集圖片。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

在給藥的30 d內(nèi)，小鼠體態(tài)和毛色正常且體質(zhì)量循序增加。各時(shí)間點(diǎn)，各組小鼠的體質(zhì)量比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示用藥組用藥后小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育未改變(見(jiàn)表2)。

表2 小鼠體質(zhì)量

3.2 瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)的影響

瑪卡復(fù)提取物中、高劑量組的負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)較空白組長(zhǎng)(P<0.05)，中劑量組小鼠在水中負(fù)重游泳時(shí)間最長(zhǎng)(見(jiàn)表3)?，斂◤?fù)方提取物低、中、高各組分別對(duì)應(yīng)的延長(zhǎng)小鼠在水中負(fù)重游泳時(shí)間的增長(zhǎng)率為36.96%、56.52%、33%，提示中劑量瑪卡復(fù)方提取物的用藥量可能為最佳用藥量。小鼠水中負(fù)重游泳時(shí)間的增長(zhǎng)率=(劑量組游泳時(shí)間平均值-空白組游泳時(shí)間平均值)/空白組游泳時(shí)間平均值×100%。

表3 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間

3.3 瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠血清中乳酸水平的影響

給藥組小鼠的血清乳酸水平低于空白組(P<0.05)，與劑量成負(fù)相關(guān)(見(jiàn)表4)?，斂◤?fù)方提取物各劑量組對(duì)應(yīng)的加快BLA的代謝率為35.52%、43.61%、51.41%，其中高劑量組的代謝率最大，說(shuō)明瑪卡復(fù)方提取物可以通過(guò)加速清除小鼠的乳酸堆積或減少小鼠體內(nèi)乳酸的產(chǎn)生起到抗疲勞作用。乳酸代謝率=(空白組乳酸水平平均值-劑量組乳酸水平平均值)/空白組乳酸水平平均值×100%

表4 小鼠乳酸水平

3.4 瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠尿素氮水平的影響

與空白組比較，給藥組小鼠90 min的無(wú)負(fù)重長(zhǎng)時(shí)間游泳后的BUN水平降低。低、中、高劑量組分別對(duì)應(yīng)的BUN代謝率為15.55%、40.91%、61.27%，代謝率與與劑量呈正相關(guān)，說(shuō)明復(fù)方是通過(guò)加快BUN的代謝，減少無(wú)負(fù)重游泳后小鼠BUN的尿素氮堆積。尿素氮代謝率=(空白組尿素氮水平平均值-劑量組尿素氮水平平均值)/空白組尿素氮水平平均值×100%

表5 小鼠尿素氮水平

3.5 瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠糖原的影響

靜息狀態(tài)下，與空白組比較，高劑量組肝糖原、肌糖原水平升高(P<0.05)；低、中劑量組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各用藥組的肝糖原增長(zhǎng)率分別為7.19%、15.11%、43.89%，肌糖原增長(zhǎng)率分別為1.66%、19.32%、36.20%，表明在靜息狀態(tài)下，瑪卡復(fù)方提取物可以通過(guò)上調(diào)小鼠的肝、肌糖原的水平，發(fā)揮抗體力疲勞功效。

表6 小鼠糖原水平

3.6 瑪卡復(fù)方提取物對(duì)小鼠肝、腎組織的影響

由圖A-D可知，各劑量組的肝小葉分界非常明顯，沿其長(zhǎng)軸走行的中央靜脈內(nèi)皮管壁完好，肝細(xì)胞環(huán)繞中央靜脈呈放射狀分布，形態(tài)正常，肝索分布齊整；核仁清晰，未見(jiàn)變性；肝血竇沒(méi)有擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)正常，沒(méi)發(fā)現(xiàn)瘀血及炎性病變；門(mén)管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，周圍沒(méi)有觀察到肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生和結(jié)締組織廣泛增生，未發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞導(dǎo)致的炎性病理改變。由圖E-G可知，藥物組的腎表面的致密結(jié)締組織完整，未見(jiàn)被膜增厚及炎性分泌；腎實(shí)質(zhì)(皮質(zhì)、髓質(zhì))分界清晰，皮質(zhì)區(qū)腎小球未見(jiàn)毛細(xì)血管基底膜或基質(zhì)增厚，纖維細(xì)胞正常分布；腎小囊腔分界明顯；腎小管構(gòu)造完整，未觀察到腎小管細(xì)胞胞質(zhì)空泡化，小管內(nèi)未見(jiàn)細(xì)胞及蛋白管型，間質(zhì)無(wú)病理變化；髓質(zhì)集合管結(jié)構(gòu)完整且清楚，未見(jiàn)病理變化。

注：A-D為肝臟組織切片在光鏡下放大100倍的HE染色圖；E-G為腎臟組織切片在光鏡下放大100倍的HE染色圖

4 討論

瑪卡的多肽[18]，多糖[19]，提取物[6]等復(fù)合物在抗體疲勞方面的研究較多，但瑪卡復(fù)方抗疲勞作用研究較少。有研究表明瑪卡粉以1.2 g/kg給小鼠持續(xù)灌胃30 d后，可以升高小鼠無(wú)負(fù)重游泳120 min后肝臟和肌肉組織中的糖原水平，抵抗運(yùn)動(dòng)疲勞[20]；瑪卡粉以1.0 g/kg 灌胃30 d后，瑪卡組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間相比空白組長(zhǎng)，瑪卡可以明顯延長(zhǎng)小鼠的游泳力竭時(shí)間[21]。瑪卡復(fù)方醇提物以瑪卡醇提浸膏與中藥復(fù)方浸膏復(fù)配，連續(xù)給藥15 d后，瑪卡復(fù)方醇提物的負(fù)重游泳時(shí)間平均值比瑪卡醇提物組長(zhǎng)，瑪卡復(fù)方醇提物能提高小鼠游泳時(shí)間，降低血清代謝物堆積[22]。有研究表明，瑪卡復(fù)方水提物的負(fù)重游泳時(shí)間較瑪卡組的負(fù)重游泳時(shí)間長(zhǎng)[20]。瑪卡復(fù)方提取物組的BUN水平均低于瑪卡水提物組[6]。本研究中，瑪卡復(fù)方水提物 0.25 g/kg、0.50 g/kg、1.00 g/kg 3個(gè)劑量均對(duì)游泳力竭小鼠具有明顯抗疲勞作用，主要表現(xiàn)在使小鼠在水中負(fù)重游泳的時(shí)間延長(zhǎng)，減少堆積在小鼠體內(nèi)的BLA、BUN代謝產(chǎn)物，使小鼠機(jī)體內(nèi)部的糖原儲(chǔ)存增加。BLA、BUN、MG、LG水平變化均與用藥有一定的劑量依賴性。對(duì)小鼠的肝和腎進(jìn)行HE染色切片觀察，結(jié)果顯示空白組和3個(gè)用藥組小鼠肝和腎組織正常，表明瑪卡復(fù)方提取物不影響肝臟和腎臟的正常代謝活動(dòng)和能量轉(zhuǎn)換，驗(yàn)證了瑪卡復(fù)方水提物不損傷小鼠的肝腎組織,具有一定安全性。

在《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中針對(duì)抗疲勞實(shí)驗(yàn)指出只要負(fù)重游泳得到的結(jié)果為陽(yáng)性，其他的抗疲勞指標(biāo)有兩項(xiàng)是陽(yáng)性結(jié)果就可以判定藥物有抗疲勞的功效[13]。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠的游泳行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、蛋白質(zhì)和糖代謝指標(biāo)均為陽(yáng)性，可判定瑪卡復(fù)方提取物具有緩解小鼠體力疲勞的功效。另外，此復(fù)方中的枸杞的抗疲勞功效也有報(bào)道[23]?，斂ā㈣坭阶?、覆盆子、無(wú)花果和白扁豆這五味藥為藥食同源，它們組為復(fù)方，可以改善瑪卡單味藥用量大的缺點(diǎn)。本研究主要從代謝產(chǎn)物和能量供應(yīng)兩方面探討了瑪卡復(fù)方提取物抗疲勞的效果，疲勞產(chǎn)生的機(jī)制較多，后期還可以從抗氧化、脂代謝、腸道菌群等方面研究其可能的抗疲勞機(jī)制和相關(guān)靶點(diǎn)。同時(shí)，本研究結(jié)果可促進(jìn)安全有效緩解體力疲勞保健食品的產(chǎn)生，瑪卡復(fù)方提取物有待成為人類抗疲勞的一款新型補(bǔ)充劑。