新型冠狀病毒重組抗原制備、純化及鑒定

范能全，張玲，任學(xué)毅，楊輝，楊黎，范開，彭蘭

·新型冠狀病毒專欄·

新型冠狀病毒重組抗原制備、純化及鑒定

范能全，張玲，任學(xué)毅，楊輝，楊黎，范開，彭蘭

401121 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（范能全、張玲、任學(xué)毅）；401331 重慶派金生物科技有限公司（楊輝、楊黎、范開）；401331 重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部（彭蘭）

制備新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的刺突蛋白（S）和核衣殼蛋白（N）重組抗原。利用 Blast 程序檢索目標(biāo)序列SARS-CoV-2 的S 蛋白和N 蛋白的同源序列，用 SWISS-MODEL 軟件對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，運(yùn)用 DISCO TOPE 對(duì) S 蛋白和 N 蛋白的 B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，選取抗原表位較多的序列進(jìn)行合成；重組抗原分離純化后制備兔抗新冠病毒蛋白多抗，用 Western blot 檢測(cè)抗原 SARS-CoV-2 的 S 蛋白以及 N 蛋白免疫學(xué)活性；用 ELISA 法檢測(cè)自制抗原與市售抗體的結(jié)合能力。重組質(zhì)粒 pET-22b-SA、pET-22b-SB、pET-22b-SC、pET-22b-NA、pET-22b-NB 測(cè)序鑒定結(jié)果顯示正確；Western blot 結(jié)果顯示，重組抗原與山羊抗兔 IgG-HRP 有特異性結(jié)合反應(yīng)，表明具有良好的免疫學(xué)反應(yīng)；ELISA 法結(jié)果顯示，重組抗原結(jié)合能力明顯強(qiáng)于市售抗 N 蛋白抗原。制備的抗原與不同靶 IgG 和 IgM 結(jié)合能力強(qiáng)，特異性高，具有開發(fā)成檢測(cè)血清SARS-CoV-2 特異性 IgG 和 IgM 抗體的試劑盒的潛力。

新型冠狀病毒； 刺突蛋白； 核衣殼蛋白； B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)； 同源性分析

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）為 2019 年12 月在湖北省武漢市暴發(fā)的一種感染性冠狀病毒。SARS-CoV-2 與 2003 年暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠狀病毒（SARS-CoV）、2012 年暴發(fā)的中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）冠狀病毒（MERS-CoV）同屬于 β-冠狀病毒屬[1]。WHO 將 SARS-CoV-2 引起的疾病命名為 COVID-19。COVID-19 臨床表現(xiàn)為肺炎、發(fā)燒、咳嗽、疲勞、腹瀉、肌肉疼痛、嚴(yán)重可致人死亡[2-4]。感染后一般潛伏期為 1 ～ 14 d。建立高效的病毒檢測(cè)方式，可有效防止病毒傳播。目前新冠病毒檢測(cè)方法分為實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 檢測(cè)病毒核酸，以及血清中新冠病毒特異性抗體 IgM 和 IgG 檢測(cè)。抗體檢測(cè)比核酸檢測(cè)具有更低的假陰性，且血清抗體檢測(cè)生物安全性更高，因此抗體檢測(cè)可作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充，并在臨床廣泛應(yīng)用[5]。

SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)主要有五部分，分別是單股正鏈核酸（ssRNA）、刺突蛋白（spike protein，S）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelop protein，E）和核衣殼蛋白（nucelocapsid protein，N）[6-9]。S 蛋白形成三聚體結(jié)構(gòu)，可識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒感染的第一步發(fā)揮重要作用。S 蛋白分為 S1 和 S2 兩個(gè)亞基。S1 亞基的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）識(shí)別并結(jié)合宿主受體。S2 介導(dǎo)病毒包膜和宿主包膜之間的融合。N 蛋白以和病毒 RNA 結(jié)合的形式存在，是感染過程中表達(dá)量最大的蛋白，且能通過甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶 2（MBL-associated serine protease 2，MASP-2）介導(dǎo)補(bǔ)體過度激活導(dǎo)致肺損傷。因此，S 蛋白和 N 蛋白是診斷和疫苗研究的重要抗原[10]。

本研究以SARS-CoV-2 S 蛋白和 N 蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，對(duì) B 細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)[11-12]，構(gòu)建重組質(zhì)粒和工程菌，制備 S 蛋白和 N 蛋白重組抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 新型冠狀病毒序列來源于 NCBI（MN908947），S 蛋白基因，N 蛋白基因序列為全基因合成，宿主菌 BL21（DE3）、載體質(zhì)粒 pET-22b、pG-KJE8 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 DNA Ligation Kit Ver.2.1（6022）、DL5000 DNA Marker（3428A）、限制性內(nèi)切酶I（1621）、限制性內(nèi)切酶I（1635）均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；山羊抗兔 IgG-HRP 為本實(shí)驗(yàn)室自制；弗氏佐劑購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2.0 ～ 2.5 kg 健康雄性成年新西蘭兔由濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（合格證號(hào)：1108252011000141），飼養(yǎng)于普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位預(yù)測(cè)

1.2.1.1 S 蛋白建模預(yù)測(cè)抗原表位 利用 Blast 程序檢索 SARS-CoV-2 序列的同源序列，其中SARS 病毒的 S 蛋白（PDB Code：6acc）與目標(biāo)序列的一致性最高，為 76.47%，以該蛋白為模板蛋白，用 SWISS-MODE L 軟件對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，質(zhì)量最好模型的 GMQE 為 0.73，QMEAN 為–3.63，該模型可以作為目標(biāo)序列的3D 結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)為三聚體，以亞基 1 為例，其中綠色為23 ～ 327 肽段，黃色為 328 ～ 694 肽段，紫色為 695 ～ 1222 肽段（圖 1）。

建模結(jié)果運(yùn)用 DISCO TOPE 對(duì) S 蛋白的 B 細(xì)胞抗原進(jìn)行分析，參與構(gòu)成 B 細(xì)胞抗原的氨基酸有：THR73、ASN74、GLY75、TYR145、HIS146、LYS147、LEU176、GLN183、GLY184、ASN185、SER247、THR250-ASP253、ASN440、SER443-TYR449、LYS458-ASN460、GLY476-SER477、GLN493-SER494、GLY496-TYR505、ASN679、PRO681-ARG685、PRO809-PRO812。根據(jù)模型結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)抗原表位，最終選取 S 蛋白中抗原表位較多的三段序列用于重組表達(dá)，分別是 SA（59-261AA）、SB（327-600AA）和 SC（696-1001AA）。

AB

Figure 1 3D model of the S protein (A, B: 3D models of the spike protein in different orientations; C: 23 - 327 amino acids;D: 328 - 694 amino acids; D: 695 - 1222 amino acids)

1.2.1.2 N 蛋白建模預(yù)測(cè)抗原表位 利用 Blast 程序檢索 SARS-CoV-2 肽段的同源序列，以 SARS 病毒的 N 蛋白 N 端序列（PDB：1ssk）為模板，序列一致性為 92.37%，用 SWISS-MODEL 軟件對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，模型的 GMQE 為 0.22，QMEAN 為–6.60，該模型可以作為N 蛋白（1 ～ 243）的 3D 結(jié)構(gòu)（圖 2A）。通過和 SARS 病毒的 N 蛋白 N 端序列作同源性分析可知，此肽段可能和病毒的 RNA 結(jié)合。以 SARS 病毒的 N 蛋白 C 端序列（PDB：2jw8）為模板，序列一致性為 95.76%，用 SWISS-MODEL 軟件對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，模型的 GMQE 為 0.17，QMEAN 為–2.02，該模型可以作為 N 蛋白 244 ～ 419 的 3D 結(jié)構(gòu)（圖 2B）。通過和 SARS 病毒的 N 蛋白 N 端序列作同源性分析可知，此肽段可能通過多聚體形成病毒的核衣殼。

建模結(jié)果運(yùn)用 DISCO TOPE 對(duì) N 蛋白的B 細(xì)胞抗原進(jìn)行分析，參與構(gòu)成 B 細(xì)胞抗原的氨基酸有：肽段（1 ～ 243）：GLY44-THR49、HIS59-ASP63、PRO67-GLY69、ASN77、PRO80、ASP81、THR91-PRO106、THR115-GLU118、GLY120、PRO122、ASN126-GLY129、GLU136、GLY137、LEU139-HIS145、THR148-ALA155、GLN163、GLY164、THR166、PRO168-GLY170；肽段（244 ～ 419）：THR247-GLN306、ALA308、GLY321-THR332、LYS338-PRO364。根據(jù)模型結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)抗原表位，最終選取 N 蛋白中抗原表位較多的兩段序列作為 N 蛋白的抗原用于重組表達(dá)，分別是 NA（1 ～ 204 AA）和 NB（210 ～ 419 AA）。

1.2.2 重組質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建 將根據(jù)抗原表位預(yù)測(cè)的SA、SB、SC、NA、NB 氨基酸序列優(yōu)化成大腸桿菌偏愛密碼子序列，進(jìn)行全基因合成。將合成的基因片段分別用I、I 酶切后，與同樣經(jīng)過I、I 酶切后的載體 pET-22b 連接，轉(zhuǎn)化宿主菌 Top10，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定。

構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-22b-SA、pET-22b-SB、pET-22b-SC、pET-22b-NA、pET-22b-NB。分別用鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌 BL21(DE3)，得到工程菌 pET-22b-SA/BL21(DE3)、pET-22b-SB/BL21 (DE3)、pET-22b-SC/BL21(DE3)、pET-22b-NA/BL21 (DE3)、pET-22b-NB/BL21(DE3)。

1.2.3 分子伴侶共表達(dá)的菌種構(gòu)建 將可表達(dá)分子伴侶的質(zhì)粒 pG-KJE8 分別與重組質(zhì)粒pET-22b-SA、pET-22b-SB、pET-22b-SC 轉(zhuǎn)染宿主菌BL21(DE3)，用100 μg/ml 氨芐青霉素以及25 μg/ml 的氯霉素LB平板，篩選陽性克隆，得到共表達(dá)宿主菌pET-22b-SA-pG-KJE8/BL21(DE3)、pET-22b-SB-pG-KJE8/BL21(DE3)、pET-22b-SC-pG- KJE8/BL21(DE3)。

1.2.4 重組抗原的表達(dá)

1.2.4.1 pET-22b-SA/BL21(DE3)、pET-22b-SB/ BL21(DE3)、pET-22b-SC/BL21(DE3) 將工程菌種活化過夜，按 2%（/）轉(zhuǎn)接至含 50 μg/ml 氨芐青霉素 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至600為 0.6 ～ 1.0，補(bǔ)入 1% 乳糖誘導(dǎo)目的蛋白、0.1% 阿拉伯糖誘導(dǎo)伴侶蛋白、10 ng/ml 四環(huán)素誘導(dǎo)分子伴侶蛋白，20 ℃誘導(dǎo)過夜。

AB

Figure 2 N-terminal and C-terminal models of the nucelocapsid protein (A: 1 - 243 amino acids of N-terminal; B: 244 - 419 amino acids of C-terminal)

1.2.4.2 pET-22b-SA-pG-KJE8/BL21(DE3)、pET- 22b-SB-pG-KJE8/BL21(DE3)、pET-22b-SC-pG- KJE8/BL21(DE3) 將工程菌種活化過夜，按 2%（/）轉(zhuǎn)接至含 50 μg/ml 卡那霉素以及 25 μg/ml 的氯霉素 LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至600為 0.6 ～ 1.0，補(bǔ)入 1% 乳糖誘導(dǎo)目的蛋白、0.1% 阿拉伯糖誘導(dǎo)伴侶蛋白、10 ng/ml 四環(huán)素誘導(dǎo)分子伴侶蛋白，20 ℃誘導(dǎo)過夜。

1.2.5 pET-22b-NA/BL21(DE3) 和 pET-22b-NB/ BL21(DE3) 發(fā)酵 將重組工程菌劃線接種于含卡那霉素的 LB 瓊脂糖平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的含卡那霉素的 LB 瓊脂糖平板上挑取菌苔接種于含 LB 液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加水定容至 1000 ml，121 ℃高壓滅菌 30 min）試管中，37 ℃培養(yǎng) 12 h，然后按 1% 的比例轉(zhuǎn)接到含 200 ml LB 培養(yǎng)液的 1000 ml 三角瓶中，37 ℃培養(yǎng)過夜即成為上罐種子液。將上罐種子液按 5% 的比例接種于含 YT 培養(yǎng)液（胰蛋白胨 4 g/L、酵母提取物 3 g/L、Na2HPO4·12H2O 30 g/L、KH2PO43 g/L、NaCl 1 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、葡萄糖 8 g/L，121 ℃高壓滅菌 30 min）的 30 L 發(fā)酵罐中，30 ℃培養(yǎng)，整個(gè)發(fā)酵過程中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來保持溶氧在 30% 以上，用 28% 的氨水調(diào)節(jié) pH 并保持在 7.0。菌液600達(dá)到 10 ～ 14 時(shí)，降低溫度至 25 ℃，加入終濃度為 0.2 mmol/L 的 IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后停止發(fā)酵，7000 r/min 離心 10 min，棄上清，收集菌體放入–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組抗原的分離純化 分別取重組抗原工程菌體 100 g，重懸于緩沖液（50 mmol/L PB、0.3 mol/L NaCl，pH 8.0）中。500 Pa 壓力勻漿破碎菌體 6 次，7000 r/min、10 ℃離心 5 min。SA、SB 和 SC 離心取沉淀，每克沉淀用 20 ml20 mmol/L Tris、2 mol/L 尿素，pH 10.0 的緩沖液重懸，離心留沉淀。每克洗滌后沉淀用 20 ml8 mol/L 尿素、0.5% Triton 50 mmol/L Tris，pH 10.0 的溶液溶解至清澈。將溶解清澈的蛋白，用截留分子量大于 14 000 D 透析袋，置于 50 mmol/L Tris pH 9.0 緩沖液中透析 16 ～ 24 h。透析后的蛋白溶液用 Ni 柱捕獲。NA 和 NB 離心收集上清液，直接用 Ni 柱捕獲。Ni 柱：Bestarose FF 博格??；再生液：100 mmol/L硫酸鎳；平衡液：20 mmol/L PB、0.5% Triton、pH 8.5 ～ 9.0；洗脫液 A：20 mmol/LPB、50 mmol/L 咪唑，pH 8.5 ～ 9.0；洗脫液 B：20 mmol/L PB、200 mmol/L 咪唑，pH 8.5 ～ 9.0。2 ～ 3 個(gè)柱體積再生 Ni Bestarose FF 柱，2 ～ 3 個(gè)柱體積平衡，蛋白溶液 20 ml/min 流速上柱，收集穿透液；用平衡液，沖洗 3 個(gè)柱體積，開始用洗脫液 A洗脫蛋白，收集洗脫 A 液中的蛋白液，沖洗 3 ～5 個(gè)柱體積后，用洗脫液 B 沖洗，收集洗脫 B 液中的蛋白液，沖洗 3 ～ 5 個(gè)柱體積后，停止沖洗。將洗脫 B 液中的目的蛋白，用截留分子量 14 000 D透析袋，置于 20 mmol/L PB 緩沖液中，透析 16 ～ 24 h。

1.2.7 多抗制備 將制備后的抗原（SA、SB、SC、NA、NB）與弗氏佐劑混合均勻后皮下多點(diǎn)注射免疫家兔。每 7 天加強(qiáng)免疫一次，共 4 次。每次加強(qiáng)免疫前采血清分別測(cè)定相應(yīng)的 IgM 和 IgG 抗體滴度。IgM 抗體滴度達(dá)到 1:1000，處死部分動(dòng)物，獲得陽性血清。IgG 滴度達(dá)到 1:100 000，處死剩余動(dòng)物獲得陽性血清。將獲得的陽性血清分別混合均勻后，經(jīng)分級(jí)硫酸銨沉淀，ProteinA 親和純化，抗原親和柱層析純化獲得相應(yīng)抗原的 IgM 和 IgG 抗體。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)抗原新冠病毒 S 蛋白以及 N 蛋白免疫學(xué)活性 將誘導(dǎo)后的重組抗原工程菌經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用制備的兔抗新冠病毒蛋白多抗與硝酸纖維素膜上的蛋白反應(yīng)，用山羊抗兔 IgG-HRP 進(jìn)行檢查，DAB 顯色，觀察目的條帶清晰時(shí)終止。

1.2.9 抗體結(jié)合能力檢測(cè) 分別將自制的抗原 SA、SB 和 SC，以及市售的新冠病毒 S 蛋白抗原 S1、S2（抗原S1 和 S2 來自于不同廠家），包被于 ELISA 板，用市售的抗 S 蛋白抗體反應(yīng)。

分別將自制的抗原 NA 和 NB，以及市售的新冠病毒 N 蛋白抗原 N1 和 N2，包被于ELISA 板，用市售的抗新冠病毒 N 蛋白兔多抗進(jìn)行反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 重組抗原基因序列分析

重組質(zhì)粒 pET-22b-SA、pET-22b-SB、pET-22b-SC、pET-22b-NA、pET-22b-NB 經(jīng)I 和I 酶切鑒定，測(cè)序鑒定結(jié)果顯示正確。DNA 序列測(cè)定，結(jié)果顯示 SA 基因 636 bp（3'端包含6 個(gè) His 密碼子序列），SB 基因 849 bp（3'端包含6 個(gè) His 密碼子序列），SC 基因 1161 bp（3'端包含 6 個(gè) His 密碼子序列），NA 基因 630 bp（3'端包含 6 個(gè) His 密碼子序列），NB 基因 741 bp（3'端包含 6 個(gè) His 密碼子序列），所有抗原基因序列與理論序列一致。

2.2 重組誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

工程菌種 pET-22b-SA/BL21(DE3)、pET-22b- SB/BL21(DE3)、pET-22b-SC/BL21(DE3) 的表達(dá)SDS-PAGE 結(jié)果顯示，目的蛋白主要在沉淀中。而分子伴侶共表達(dá)菌種，SA、SB 可溶性部分明顯增加。N 蛋白抗原在低溫誘導(dǎo)后，以可溶性方式存在。

工程菌誘導(dǎo)表達(dá)，再經(jīng)過純化分離后，得到樣品純度大于 90% 的重組抗原（圖 3、圖 4）。

2.3 Western blot 檢測(cè)重組抗原的特異性

Western blot 結(jié)果顯示：SA 抗原在 23 kD 位置有明顯顯色條帶；SB 在 30 kD 位置有明顯顯色條帶；SC 在 41.2 kD 位置有明顯顯色條帶；NA 在22 kD 位置有明顯顯色條帶；NB 在 23 kD 位置有明顯顯色條帶；且均無明顯的非特異性條帶產(chǎn)生。

圖 3 重組抗原的誘導(dǎo)表達(dá)以及分離純化結(jié)果[A：pET-22b-SA/BL21(DE3) 重組抗原的誘導(dǎo)表達(dá)（1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo) 3 h后；3：分離純化后得到的重組抗原 SA）；B：pET-22b-SC/BL21(DE3) 重組抗原的誘導(dǎo)表達(dá)（1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo) 4 h后；3：分離純化后得到的重組抗原 SC）；C：pET-22b-NA/BL21(DE3) 重組抗原的誘導(dǎo)表達(dá)（1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo) 4 h后；3：分離純化后得到的重組抗原 NA）；D：pET-22b-NB/BL21(DE3) 重組抗原的誘導(dǎo)表達(dá)（1：誘導(dǎo)前；2：誘導(dǎo) 4 h后；3：分離純化后得到的重組抗原NB）]

Figure 3 Recombinant antigen expression and purification [A: pET-22b-SA/BL21(DE3) expression of recombinant antigens(1: Uninduced; 2: Induced; 3: Purified recombinant antigen SA); B: pET-22b-SC/BL21(DE3) expression of recombinant antigens(1: Uninduced; 2: Induced; 3: Purified recombinant antigen SC); C: pET-22b-NA/BL21(DE3) expression of recombinant antigens(1: Uninduced; 2: Induced; 3: Purified recombinant antigen NA); D: pET-22b-NB/BL21(DE3) expression of recombinant antigens(1: Uninduced; 2: Induced; 3: Purified recombinant antigen NB)]

1：pET-22b-SB/BL21(DE3) 誘導(dǎo)后菌體破菌上清液；2：pET-22b-SB/BL21(DE3) 誘導(dǎo)后菌體破菌沉淀；3：pET-22b-SB-pG-KJE8/BL21(DE3) 誘導(dǎo)菌體破菌上清液；4：pET-22b-SB-pG-KJE8/BL21(DE3) 誘導(dǎo)菌體破菌沉淀；5：分離純化后得到的重組抗原 SB

1: pET-22b-SB/BL21(DE3) lysate supernatant; 2: pET-22b-SB/BL21(DE3) lysate precipitation; 3: pET-22b-SB-pG-KJE8/BL21(DE3) lysate supernatant;4: pET-22b-SB-pG-KJE8/BL21(DE3) lysate precipitation; 5: Purified recombinant antigen SB

圖 4 分子伴侶共表達(dá)對(duì)重組抗原的溶解性影響

Figure 4 The effect of chaperone co-expression on the solubility of recombinant antigens

表 1 自制/市售 S 抗原與市售S 蛋白抗體免疫反應(yīng)（OD值）

表 2 自制/市售N 抗原與市售 N 蛋白抗體免疫反應(yīng)（OD值）

2.4 ELISA 法檢測(cè)自制抗原與市售抗體的結(jié)合能力

分別將制備的抗原 SA、SB 和 SC，以及市售的新冠病毒 S 蛋白抗原 S1、S2（抗原S1 和 S2 來自于不同廠家），包被于 ELISA 板，用市售的抗S 蛋白抗體反應(yīng)，對(duì)比結(jié)果顯示，本方法制備的抗原結(jié)合能力明顯強(qiáng)于市售 S 蛋白抗原（表 1）。

將制備的抗原 NA、NB 以及市售的新冠病毒 N 蛋白抗原 N1 和 N2，分別包被于 ELISA 板，用市售的抗新冠病毒 N 蛋白兔多抗進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)比結(jié)果顯示，本方法制備的抗原結(jié)合能力明顯強(qiáng)于市售抗 N 蛋白抗原（表 2）。

3 討論

目前新冠疫情防控檢測(cè)，主要以實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè) SARS-CoV-2 核酸陽性，或者病毒基因測(cè)序與已知 SARS-CoV-2 高度同源作為確診依據(jù)。但由于核酸檢測(cè)受限于采樣以及樣本操作處理?xiàng)l件，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性或者假陽性。因此血清檢測(cè) SARS-CoV-2 特異性 IgG 和 IgM 抗體檢測(cè)可彌補(bǔ)這一缺陷[13]。不同廠家檢測(cè)的靶抗原不同，導(dǎo)致檢測(cè)靶 IgG 和 IgM 抗體陽性率有差異[14]。

本文通過 DISCO TOPE 對(duì) SARS-CoV-2 的 S 蛋白和N 蛋白的 B 細(xì)胞抗原表位分析，經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)得到 S 蛋白以及 N 蛋白抗原序列。采用大腸桿菌配合分子伴侶共表達(dá)體系，獲得重組抗原。與市售抗原相比較，市售的大腸桿菌重組抗原，多為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且與天然結(jié)構(gòu)差異較大，抗體結(jié)合能力較差。自制的抗原穩(wěn)定性好，構(gòu)象接近天然抗原，能特異性與市場(chǎng)上各類 SARS-CoV-2 的 IgG 和 IgM 靈敏反應(yīng)。側(cè)面反映了本方法制備的抗原，與不同靶 IgG 和 IgM 結(jié)合能力強(qiáng)，特異性高，具有開發(fā)成檢測(cè)血清 SARS-CoV-2 特異性 IgG 和 IgM 抗體的試劑盒的潛力。

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Preparation, purification, and identification of recombinant antigens of the novel coronavirus

FAN Neng-quan, ZHANG Ling, REN Xue-yi, YANG Hui, YANG Li, FAN Kai, PENG Lan

Author Affiliations:Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China (FAN Neng-quan, ZHANG Ling, REN Xue-yi); Chongqing PEG-BIO Biopharm Co., Ltd, Chongqing 401331, China (YANG Hui, YANG Li, FAN Kai); Department of Basic, Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China (PENG Lan)

To prepare the recombinant antigens spike protein (S) and nucleocapsid protein (N) of the novel coronavirus (2019-novel coronavirus, SARS-CoV-2).Homologous sequences of S and N proteins of the destination sequence were retrieved using blast. The structures of the target sequences were modeled with the swiss-model software. The B - cell antigens of S and N proteins were analyzed using DISCO TOPE. The sequences of multiple epitopes were selected for synthesis. The rabbit anti - virus protein against the SARS-CoV-2 was prepared after the separation and purification of recombinant antigen. The immunological activities of S and N proteins of SARS-CoV-2 antigen were detected using with Western blot. ELISA was used to detect the binding capacity of homemade antigen and commercial antibody.Sequence results of the recombined plasmids including pET-22b-SA, pET-22b-SB, pET-22b-SC, pET-22b-NA, and pET-22b-NB were identified. Western blot results showed that the recombinant antigen has specific binding responses to the goat anti-rabbit IgG-HRP, suggesting a good immune response. ELISA results showed that the binding capacity of the recombinant antigen was dramatically better than the commercial N protein antigen.The present antigen has strong binding capability against different targeting IgG and IgM with high specificity and has potential to develop the serum detection kits for the SARS-CoV-2 specific IgG and IgM antibody.

SARS-CoV-2; spike protein; nucelocapsid protein; B cell epitope prediction; homology analysis

PENG Lan, Email: pl2007pl@sohu.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.001

重慶市自然科學(xué)基金（cstc2020jcyj-msxmx0934）

彭蘭，Email：pl2007pl@sohu.com

2022-01-21