基于酶電極技術(shù)豆豉中谷氨酸含量快速測定的方法

杜祎，張金玲，朱凱，朱思榮，史建國，張利群，畢春元

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院生物研究所，濟南 250014)

豆豉是用豆類經(jīng)過多種微生物發(fā)酵制得的豆制品調(diào)味料，有著悠久的歷史，是我國傳統(tǒng)調(diào)味食品之一，在烹飪時加入豆豉可以增加菜品的香味，因此豆豉受到全國人民的青睞[1-5]。隨著生活水平的提高，人們對豆豉的風(fēng)味和品質(zhì)提出了更高的要求。谷氨酸是豆豉中一種重要的風(fēng)味物質(zhì)，因此，如何檢測豆豉中的谷氨酸含量顯得尤為重要。

目前，國內(nèi)外檢測谷氨酸含量的方法主要是液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子交換色譜法，這些方法一般需要專業(yè)操作人員，且樣品需要繁瑣復(fù)雜的衍生化等預(yù)處理，所需試劑大多對人體有害，操作復(fù)雜，檢測成本高[6-11]。本研究采用固定化谷氨酸氧化酶酶電極技術(shù)在恒體積反應(yīng)池內(nèi)對豆豉懸濁液進行檢測，對線性、穩(wěn)定性、專一性等方面進行評價和加標(biāo)回收實驗，多方位驗證方法的可靠性，為快速檢測食品中谷氨酸含量提供了思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉：從濟南市環(huán)山銀座購置兩種某品牌在售品；谷氨酸氧化酶、牛血清蛋白：美國Sigma公司；戊二醛：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；核微孔膜：美國Nucleopore公司；過氧化氫電極、SBA緩沖劑、“O”形圈：山東省科學(xué)院生物研究所；實驗中所用試劑均為分析純，實驗中所用水為純凈水。

SBA-40D型谷氨酸生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；分析天平 德國賽多利斯集團；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；萬能高速粉碎機 永康市藍晴工貿(mào)有限公司；漩渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司；50 μL微量進樣器 上海光正醫(yī)療儀器有限公司；離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；干燥器 四川蜀玻集團有限責(zé)任公司。

1.2 測定原理

將谷氨酸氧化酶固定化在聚碳酸酯膜上，以SBA緩沖劑為貼合劑與過氧化氫電極自組裝成谷氨酸酶電極。在反應(yīng)池內(nèi)，谷氨酸與谷氨酸氧化酶接觸后發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生過氧化氫，見公式(1)，過氧化氫在酶電極表面發(fā)生電子得失，產(chǎn)生電流，該電流強度與谷氨酸含量成比例，見公式(2)，通過檢測電流強度來實現(xiàn)谷氨酸含量的檢測。

H2O2，

(1)

(2)

1.3 試劑及酶電極器件準(zhǔn)備

1.3.1 100 mg/dL谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取谷氨酸鈉鹽適量，放入30 g稱量瓶內(nèi)，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，104 ℃處理4 h，取出稱量瓶，蓋上蓋子，放入干燥器中冷卻至室溫。用分析天平準(zhǔn)確稱取1.000 g谷氨酸于250 mL燒杯內(nèi)，加入純凈水溶解，轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，定容。

1.3.2 谷氨酸氧化酶膜的制備

將核微孔膜制作成直徑為0.6 cm的小圓片，正面朝上粘貼在“O”形圈上，然后將牛血清蛋白、2.5%戊二醛、谷氨酸氧化酶的混合液涂抹于核微孔膜的背面，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，于35 ℃干燥30 min，取出后放入冰箱上層，4 ℃冷藏。

1.3.3 谷氨酸酶電極的自組裝

在過氧化氫表面滴1滴SBA緩沖劑，將制備好的谷氨酸氧化酶膜背面浸入SBA緩沖劑中，壓緊，擠出氣泡，通過白色螺紋固定套將谷氨酸酶電極固定在SBA谷氨酸生物傳感器反應(yīng)池內(nèi)。

1.3.4 樣品測定

取適量豆豉在攪拌機中打碎，并在振蕩器上振蕩3 min，取1 g樣品放入10 mL燒瓶中，加入純凈水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容。

在SBA-40D谷氨酸反應(yīng)池內(nèi)注入緩沖劑，裝入谷氨酸酶電極，接通電源，當(dāng)儀器提示定標(biāo)時，用50 μL微量進樣器注入25 μL配制好的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液定標(biāo)，當(dāng)儀器再次提示定標(biāo)時，用同樣的方法再次注入谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，直至儀器提示定標(biāo)通過，然后用樣品潤洗微量進樣器3次后準(zhǔn)確吸取25 μL樣品，在儀器提示進樣品時將其快速注入反應(yīng)池，測定結(jié)束后，儀器自動顯示測定結(jié)果并打印。

1.4 谷氨酸檢測方法評價

1.4.1 穩(wěn)定性評價

定標(biāo)通過后，連續(xù)10次測定同一濃度為100 mg/dL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，對測定結(jié)果進行計算，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價該方法的穩(wěn)定性。

1.4.2 線性評價

定標(biāo)通過后，分別測定濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/dL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度平行測定3次，對測定結(jié)果進行計算，評價該方法的線性。

1.4.3 專一性評價

分別配制濃度為100 mg/dL的甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，用同樣的方法進行檢測，評價該方法的專一性。

1.4.4 加標(biāo)回收率計算

分別選用5個豆豉樣品A、B、C、D、E，經(jīng)預(yù)處理后，從5個樣品待測液中分別吸取5 mL放入試管內(nèi)，再對應(yīng)加入5 mL濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/dL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)號A1、B1、C1、D1、E1；同時，從A、B、C、D、E 5個樣品待測液中吸取5 mL放入試管內(nèi)，分別加入5 mL純凈水，標(biāo)號A2、B2、C2、D2、E2；混勻后，對10支試管內(nèi)的樣品進行測定，計算加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率計算公式為：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性檢測結(jié)果

對同一濃度為100 mg/dL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液進行10次測定，結(jié)果見表1。

表1 生物傳感器法測定谷氨酸含量

由表1可知，檢測結(jié)果與實際樣品濃度一致，重復(fù)測定10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%，證明本研究提供的檢測方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 線性計算結(jié)果

對每一個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液進行3次平行測定，取平均值，將結(jié)果繪成散點圖，結(jié)果見圖1。

圖1 谷氨酸酶電極對谷氨酸的響應(yīng)

由圖1可知，儀器對谷氨酸的測定具有很好的線性，線性方程為y=0.9942x+0.5262，R2=0.9999。

2.3 專一性檢測結(jié)果

分別對濃度為100 mg/dL的谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)液用生物傳感器法進行測定，測定結(jié)果見表2。

表2 生物傳感器法測定谷氨酸專一性的結(jié)果

由表2可知，除谷氨酸外，其他氨基酸基本上沒有響應(yīng)，證明該方法對谷氨酸的測定具有很好的專一性。

2.4 加標(biāo)回收率計算結(jié)果

生物傳感器法所測定的5種樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。

表3 生物傳感器法測定谷氨酸含量的加標(biāo)回收率

由表3可知，酶電極法所測定的5種樣品的回收率在98.3%～100.8%之間，回收率較高。

2.5 樣品濃度

采用酶電極法對超市中出售的2種品牌的豆豉中的谷氨酸含量進行測定，結(jié)果見表4。

表4 酶電極法測定豆豉中谷氨酸含量

由表4可知，2份樣品中均含有谷氨酸，檢出率為100%，第1份樣品中谷氨酸平均濃度為8.0 mg/dL，第2份樣品中谷氨酸平均濃度為12.8 mg/dL，符合樣品包裝對氨基酸含量的規(guī)定，與實際結(jié)果相符。第1份樣品中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%，第2份樣品中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.31%，說明酶電極法測定豆豉中谷氨酸含量具有穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

谷氨酸是重要的鮮味劑，對香味具有增強作用。本研究制備了谷氨酸氧化酶酶膜，借助SBA-40D型谷氨酸生物傳感分析儀建立了酶電極法檢測豆豉中谷氨酸含量的方法，并研究了該方法的線性范圍、穩(wěn)定性、專一性和回收率等性能指標(biāo)，都獲得了令人滿意的結(jié)果。因此，采用酶電極法測定豆豉中谷氨酸的含量具有可行性，這為食品中谷氨酸含量的快速檢測提供了思路。另外，該方法響應(yīng)時間為20 s，所用酶膜可重復(fù)使用1000次，測定過程沒有產(chǎn)生有毒、有害物質(zhì)，符合國家綠色環(huán)保、節(jié)能減排政策。將該方法向谷氨酸生產(chǎn)企業(yè)推廣，可縮短檢測時間，減少試劑使用，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，大大提高檢測效率。