液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用定量分析食品中苯嘧磺草胺殘留

袁 曉，李 青，李麗君，鄭美娟

（1. 廣電計(jì)量檢測(cè)（湖南）有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410221；2. 貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽(yáng) 550002）

苯嘧磺草胺是由巴斯夫公司開發(fā)的一款脲嘧啶類除草劑?；瘜W(xué)名稱N'-[2-氯-4-氟-5-(3-甲基-2,6-二氧-4-(三氟甲基)-3,6-二氫-1(2H)-嘧啶)苯甲酰]-N-異丙基-N-甲基硫酰胺，分子式C17H17ClF4N4O5S，分子量500.85[1]。對(duì)于草甘磷和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑如磺酰脲類、嘧啶水楊酸類有抗性的闊葉雜草和一些莎草科雜草，苯嘧磺草胺有較好的防治效果，其主要作用機(jī)制是抑制光合系統(tǒng)中的原卟啉原IX 氧化酶（PPO）活性，造成原卟啉IX（Proto）及過(guò)氧化氫在葉片組織中積累，在光照下Proto 分子與氧反應(yīng)形成單態(tài)氧與氧基，使細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸過(guò)氧化，造成膜的透性與功能迅速喪失，導(dǎo)致組織壞死、生長(zhǎng)受抑制和植株死亡[2]。

GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中針對(duì)不同的動(dòng)物和植物源性食品規(guī)定了苯嘧磺草胺的臨時(shí)限量（0.01～1 mg/kg）[3]，但是沒(méi)有指定檢測(cè)方法。查閱現(xiàn)行有效的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)，也未找到相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。在《關(guān)于在各種食品中設(shè)立苯嘧磺草胺最大殘留限量的合理化意見(jiàn)》（EFSA 2012b）[4]中提到了歐洲食品安全局建立的苯嘧磺草胺檢測(cè)方法，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，提取溶劑為甲醇水溶液（70/30, v/v）和乙腈，定量限為0.03 mg/kg（植物源性食品）和0.01 mg/kg（動(dòng)物源性食品），具體的色譜和質(zhì)譜條件沒(méi)有披露。

苯嘧磺草胺是一種新型農(nóng)藥殘留，目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)苯嘧磺草胺的相關(guān)研究報(bào)道很少，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道都是涉及藥物合成[5-6]、除草活性測(cè)定[7-8]及原藥中含量測(cè)定[9-10]。原藥中苯嘧磺草胺測(cè)定方法為液相色譜法，前處理為直接溶解上樣，對(duì)于復(fù)雜的植物源性食品和動(dòng)物源性食品中低含量苯嘧磺草胺的檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。檢測(cè)方法的缺失必然會(huì)給農(nóng)藥殘留量監(jiān)測(cè)和施用控制帶來(lái)隱患，本研究旨在建立一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中苯嘧磺草胺殘留量的方法，為苯嘧磺草胺的代謝研究和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜質(zhì)譜儀：Waters XEVO TQ-S micro（美國(guó)沃特世公司）；超高速冷凍離心機(jī)[力新儀器(上海)有限公司]；氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；渦旋振蕩器（上海邁旗環(huán)?？萍加邢薰荆?；電子天平（ME204E，梅特勒托利多公司）；固相萃取儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；ProElut DPC 固相萃取柱（迪馬科技有限公司）；0.22 μm 的有機(jī)濾膜（迪馬科技有限公司）。

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；甲酸（99%）；氯化鈉（分析純），苯嘧磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)自上海安譜科技有限公司。

1.2 試劑與樣品

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：苯嘧磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品（PESTANAL?），CAS 號(hào)372137-35-4，純度≥99%。準(zhǔn)確稱取0.01 g苯嘧磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶，加入乙腈溶解后定容至刻度。配制成濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于-18℃保存，有效期6 個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取0.1 mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶，用乙腈定容，配制成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-18℃保存，有效期1 個(gè)月。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g 樣品（豬肉、雞蛋、上海青、梨、牛奶）于離心管，加入10 mL 乙腈和4.00 g NaCl，混合渦旋1 min，超聲提取10 min，6 000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液待凈化。加10 mL 乙腈活化固相萃取柱，棄去上清液，將待凈化液加入小柱，收集流出液，加入10 mL 乙腈，合并流出液，50 ℃水浴氮吹至近干，用1 mL 乙腈溶劑殘留物，過(guò)0.22 μm 濾膜后供液相色譜質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相條件液相條件如下：色譜柱為C18 柱（2.6 μm，100 mm×3 mm）；流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，柱溫35℃，流動(dòng)相A 相為0.1%甲酸水，B 相為乙腈。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件如表2 所示。掃描模式MRM 掃描，正負(fù)離子同時(shí)掃描，氣簾氣30 Psi，離子化電壓正離子+5 500V，負(fù)離子-4 500V，去溶劑氣溫度550℃，噴霧氣Gas1：55 Psi，輔助加熱氣Gas1：55 Psi。

表2 苯嘧磺草胺質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件確認(rèn)

在雞蛋樣品中加入一定濃度的目標(biāo)物，混合均勻后于4℃放置24 h。稱取同等質(zhì)量的多份上述雞蛋樣品，加入100 μg/kg 苯嘧磺草胺標(biāo)準(zhǔn)物，分別加入5、10、12、15 mL 的乙腈，加入同樣質(zhì)量的NaCl，超聲提取凈化后進(jìn)行測(cè)定。

表3 是采用不同體積的乙腈提取加標(biāo)樣品后獲得的峰面積、響應(yīng)值和檢測(cè)值。結(jié)果表明，隨著提取體積的增加，目標(biāo)物的檢測(cè)值依次增加，10 mL 與5 mL相比檢測(cè)值增加明顯，而使用12 mL 和15 mL 溶劑提取后，峰面積與檢測(cè)值無(wú)明顯差異，說(shuō)明10 mL 乙腈的提取效率已可滿足前處理的需要，最終選擇10 mL 作為提取液體積，不同提取液體積測(cè)試結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表3。

表3 不同體積提取溶劑結(jié)果對(duì)比

2.2 儀器條件的確定

選擇乙腈-水、甲醇-水、甲酸水-乙腈的流動(dòng)相組合進(jìn)行比對(duì)，主要考察目標(biāo)物的分離度，同濃度下的響應(yīng)值，在以乙腈∶0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)物的分離度效果最好，最終其作為本方法的流動(dòng)相。通過(guò)對(duì)苯嘧磺草胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)注入質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有348.2 和328 兩個(gè)較大的離子碎片，且328 碎片響應(yīng)度高且穩(wěn)定，可以選作定量離子，將響應(yīng)低的348.2 碎片作為定性離子。圖1 a-c 分別為苯嘧磺草胺定性離子、定量離子、總離子流解析圖。

圖1 苯嘧磺草胺定量離子（上）、定性離子（中）和總離子流（下）圖

2.3 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

用標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成濃度為10、20、50、100、200 ng/mL 的工作曲線（圖2）。以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線。檢出限按信噪比S/N=3，定量限按信噪比S/N=10 計(jì)算。在0.01～10.0 mg/kg 范圍內(nèi)苯嘧磺草胺線性關(guān)系良好，線性方程為y=24.1361x-16.0385，R=0.9996，檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.006 mg/kg。

圖2 苯嘧磺草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 不同基質(zhì)中的響應(yīng)度

針對(duì)常見(jiàn)的食品，選擇豬肉、雞蛋、蔬菜（上海青）、水果（梨）、雞蛋、牛奶分別配制基質(zhì)曲線。表4 為不同食物基質(zhì)中10、20、50、80、100 μg/kg 5 個(gè)濃度定量離子峰面積與溶劑基質(zhì)的對(duì)比，由表4 可以看出，苯嘧磺草胺在5 種基質(zhì)中的響應(yīng)度與溶劑基質(zhì)差異不大，雖然牛奶基質(zhì)中苯嘧磺草胺整體響應(yīng)度相對(duì)較低，但由圖3 可知，曲線最低濃度在牛奶基質(zhì)中也能很好的定性和定量，常見(jiàn)的豬肉、雞蛋、蔬菜、水果、牛奶中添加10 μg/kg 苯嘧磺草胺質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出，各基質(zhì)均能很好的定性和定量。綜上所述，此檢測(cè)方法能適用于上動(dòng)物源性和植物源性食物中苯嘧磺草胺殘留量的檢測(cè)。

表4 不同基質(zhì)基中定量離子峰面積對(duì)比

圖3 牛奶中添加10 μg/kg 苯嘧磺草胺檢測(cè)的定量離子（上）、定性離子（下）圖

圖4 不同基質(zhì)中添加10 μg/kg 苯嘧磺草胺質(zhì)譜圖

2.5 方法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

在不同的植物源性食品基質(zhì)和動(dòng)物源性食品基質(zhì)中，分別添加不同濃度的苯嘧磺草胺回收率在88.9%-110.3%之間（表5），符合檢測(cè)要求。

表5 不同基質(zhì)基中三添加水平回收率對(duì)比

3 討 論

歐洲食品安全局（European Food Safty Authority，EFSA）在2012 年公布的《關(guān)于在各種食品中設(shè)立苯嘧磺草胺最大殘留限量的合理化意見(jiàn)》（EFSA 2012b）[4]中收集了苯嘧磺草胺的急性毒性、短期毒性等毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)，同時(shí)設(shè)計(jì)了一系列使用試驗(yàn)（針對(duì)作物）、喂養(yǎng)試驗(yàn)（針對(duì)牲畜），然后檢測(cè)苯嘧磺草胺在動(dòng)植物體內(nèi)殘留，最后評(píng)估出苯嘧磺草胺的可接受攝入量為0.05 mg/kg 體重，急性中毒參考劑量也是同樣水平。該文件依據(jù)評(píng)估數(shù)據(jù)制定了苯嘧磺草胺在不同食品中的殘留量限值，同時(shí)還指出苯嘧磺草胺的主要代謝物為三氟乙酸（TFA），但是三氟乙酸缺乏毒理學(xué)參考數(shù)據(jù)和殘留量數(shù)據(jù)，無(wú)法進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。因此歐洲食品安全局在2014 年又發(fā)布了《不同作物中苯嘧磺草胺限值的合理化建議-基于代謝物三氟乙酸相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估》（EFSA 2014b）[11]，公布了三氟乙酸的毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)，并對(duì)哺乳動(dòng)物中三氟乙酸暴露風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估，根據(jù)評(píng)估數(shù)據(jù)修改了部分食品中的苯嘧磺草胺殘留量限值。

苯嘧磺草胺是名副其實(shí)的暢銷農(nóng)藥。苯嘧磺草胺在中國(guó)的專利為2001 年申請(qǐng)的《尿嘧啶取代的苯基氨磺酰羧酰胺》[13]，已經(jīng)于2021 年4 月到期。脫離專利保護(hù)之后，苯嘧磺草胺在中國(guó)的產(chǎn)量和應(yīng)用量有可能會(huì)大大增加。值得注意的是，國(guó)標(biāo)中規(guī)定某種農(nóng)藥限量為臨時(shí)限量，一般是因?yàn)樵撐镔|(zhì)沒(méi)有完整毒理學(xué)結(jié)論、膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)或沒(méi)有檢驗(yàn)方法，無(wú)論是哪一種情況，對(duì)于一種正在被日益廣泛使用的農(nóng)藥來(lái)說(shuō)，缺少可靠的定量檢測(cè)方法都是一個(gè)極大的隱患。

歐洲食品安全局建立的苯嘧磺草胺檢測(cè)方法，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，提取溶劑為甲醇水溶液（70/30, v/v）和乙腈，定量限為0.03 mg/kg（植物源性食品）和0.01 mg/kg（動(dòng)物源性食品），具體的提取方法、色譜條件和質(zhì)譜條件沒(méi)有披露。而此研究的方法定量限優(yōu)于歐盟方法，提取溶劑也由2 種改為1 種，前處理復(fù)雜程度和試驗(yàn)成本應(yīng)該也有所降低。

4 總 結(jié)

研究建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定植物源性食品中苯嘧磺草胺殘留量的方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，過(guò)固相萃取柱凈化，氮吹濃縮后上機(jī)檢測(cè)。在0.01～10.0 mg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=24.1361x-16.038 5，（R=0.999 6），檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.006 mg/kg。方法穩(wěn)定性較好，精密度高，檢出限和定量限能夠滿足GB 2763—2021 中苯嘧磺草胺的限值要求，能夠?yàn)楸洁谆遣莅返暮罄m(xù)研究以及監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。