胰高血糖素樣肽-1受體敲除H9c2細(xì)胞株建立及其抗凋亡作用初探

林箏鳴 錢航 李東鋒 許浩 陳繼舜 閔新文 陳俊 李小雷 楊漢東

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442008)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者的主要心臟并發(fā)癥之一，DCM是指在無(wú)冠心病、高血壓、瓣膜或先天性心臟病的情況下所致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。雖然DCM定義明確，但其病理生理機(jī)制仍待闡明[1-2]。有研究[3]表明，心肌細(xì)胞的凋亡在DCM的發(fā)展中至關(guān)重要。

甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)是晚期糖基化終產(chǎn)物的主要前體，有研究[4-6]表明，MGO促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡及心功能障礙。線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，在各種刺激下，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)下降的同時(shí)線粒體膜通透性發(fā)生改變，使細(xì)胞色素c從線粒體滲漏至細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)胱天蛋白酶-3(caspase-3)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。有研究[8-9]表明，MGO通過(guò)誘導(dǎo)線粒體功能損傷，導(dǎo)致β細(xì)胞和肝細(xì)胞凋亡。此外，心肌細(xì)胞在MGO誘導(dǎo)下線粒體活性氧產(chǎn)生增加，MMP降低，細(xì)胞凋亡顯著增加[10]。MGO通過(guò)乙二醛酶(glyoxalase，GLO)系統(tǒng)解毒，使MGO脫毒為D-乳酸，抑制細(xì)胞損傷及凋亡[11]。

胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)是B類G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一員。但因?yàn)闄z測(cè)手段敏感性和特異性的限制及不同物種之間GLP-1R的表達(dá)差異，GLP-1R在心臟的精確定位一直存在爭(zhēng)議[12]。有研究表明在人類心臟的四個(gè)腔室中均檢測(cè)到GLP-1R mRNA表達(dá)。然而通過(guò)原位雜交僅在右心房檢測(cè)到GLP-1R的存在[13]。與之相悖的是，Clarke等[14]用單克隆抗體3F52免疫組織化學(xué)檢測(cè)到人類心房肌和心室肌中有廣泛的GLP-1R免疫陽(yáng)性細(xì)胞。在另一項(xiàng)使用單克隆抗體3F52對(duì)人類的心臟GLP-1R定位的試驗(yàn)[15]中表明，竇房結(jié)細(xì)胞GLP-1R免疫反應(yīng)陽(yáng)性。對(duì)小鼠心臟GLP-1R表達(dá)的分析顯示，心室GLP-1R mRNA轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)低于心房[16]。在大鼠心臟中，通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡法均檢測(cè)到了GLP-1R的表達(dá)，在缺血再灌注損傷后，GLP-1R的表達(dá)水平顯著降低[17]。但該實(shí)驗(yàn)并未對(duì)大鼠心臟GLP-1R的表達(dá)進(jìn)行精確的定位。在眾多以H9c2細(xì)胞為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)及其類似物能通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抑制線粒體功能障礙、改善能量代謝、逆轉(zhuǎn)心肌肥厚等機(jī)制，在心肌細(xì)胞應(yīng)對(duì)不同的損傷時(shí)表現(xiàn)出良好的心肌保護(hù)作用[18-21]，雖然這些研究并未深入地對(duì)H9c2細(xì)胞GLP-1R的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，但GLP-1R激動(dòng)劑對(duì)心肌的保護(hù)作用也能驗(yàn)證GLP-1R在H9c2細(xì)胞的表達(dá)及功能。另有研究[22]表明，GLP-1能有效地提高脂肪組織中GLO1的活性。盡管之前的多項(xiàng)研究已揭示GLP-1R激動(dòng)劑對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，但這些作用的機(jī)制至今尚未完全闡明。本研究旨在發(fā)現(xiàn)GLP-1R在MGO誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的保護(hù)作用。

CRISPR/Cas9是原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)，能抵御外源遺傳物質(zhì)的入侵，由此發(fā)展的基因編輯技術(shù)能很好地實(shí)現(xiàn)基因的敲除及敲入[23-24]。此外，尚未有研究基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除H9c2細(xì)胞GLP-1R基因研究其生理重要性。因此，本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除H9c2細(xì)胞的GLP-1R基因，構(gòu)建GLP-1R基因敲除H9c2細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，觀察GLP-1R缺乏對(duì)H9c2細(xì)胞表型的影響，旨在研究GLP-1R蛋白的表達(dá)對(duì)MGO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用及通過(guò)調(diào)節(jié)GLO1的解毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))、DNA膠回收試劑盒(生工SanPrep)、pSpCas9-puro載體(Addgene)、限制性內(nèi)切酶(Biolabs)、膠回收試劑盒(Qiagen)、無(wú)縫克隆試劑盒(Clontech)、質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen)、嘌呤霉素(Ubigene Bioscience Co.Ltd.，Guangzhou，China)、MGO(M0252，Sigma)、GLP-1R抗體(26196-1-AP，Proteintech)、GAPDH抗體(AntGene)、二抗山羊抗兔(AntGene)、CCK-8試劑盒(C0005，Targetmol)、F-actin(C2207S，Beyotime)、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1028，碧云天)、JC-1試劑盒(碧云天)、RNasin?RNA酶抑制劑(N251A，Promega)、M-MLV(M170B，Promega)、M-MLV×5(M531A，Promega)、GoTaq?qPCR(A600A，Promega)、dNTP(上海生工)、Oligdt(上海生工)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物合成(Sangon Biotech)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力測(cè)定

大鼠H9c2心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液和37 ℃、5%的CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)按1:3進(jìn)行傳代。用CCK-8試劑測(cè)定細(xì)胞活力。將GLP-1R-/-組和野生型(wild-type，WT)組的H9c2細(xì)胞分別接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h后更換為含有1% FBS的DMEM培養(yǎng)基饑餓處理16 h。將不同濃度的MGO(0～100 μmol/L，用PBS稀釋)處理細(xì)胞24 h，或用50 μmol/L MGO處理細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(0～48 h)。酶標(biāo)儀讀取吸光值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3 靶位點(diǎn)及鑒定引物設(shè)計(jì)

使用在線CRISPR設(shè)計(jì)工具(https://en.rc-crispr.com/)網(wǎng)站，搜索GLP-1R基因(ID：25051)信息。以GLP-1R基因2號(hào)外顯子為靶點(diǎn)分別在其外側(cè)及內(nèi)部設(shè)計(jì)4條向?qū)NA(guide RNA，gRNA)(圖1)。在該基因的外顯子序列中尋找PAM序列(NGG)，選取該序列上游緊鄰的20 bp堿基序列作為gRNA，最終選擇4條gRNA：gRNA1：5’-GGATTGCACAAGGTTGCCGTGGG-3’、gRNA2：5’-GCTCCCGCACCCCTCCAAAGAGG-3’、gRNA3：5’-GGACACCGTGGCACCCTATGAGG-3’和gRNA4：5’-TGAAGTGTAGCGTAGTCACCAGG-3’，同時(shí)設(shè)計(jì)靶序列的鑒定引物(圖1和表1)。

圖1 GLP-1R gRNA靶位點(diǎn)突變鑒定引物

表1 GLP-1R gRNA靶位點(diǎn)突變鑒定引物序列

1.4 目的基因片段獲得

采用PCR產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄的方法合成gRNA。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，瓊脂糖凝膠電泳后，用生工的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒做膠回收。

1.5 目的基因構(gòu)建入線性化載體中

用BbsI酶切pSpCas9-puro載體，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中切割下來(lái)，用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)做膠回收。使用無(wú)縫克隆試劑盒，將目的基因片段和線性化載體加到離心管中進(jìn)行重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至E.coli Stbl3 感受態(tài)細(xì)胞中，把轉(zhuǎn)化物涂到LB平板上，孵育過(guò)夜，挑取轉(zhuǎn)化子重懸，行菌落PCR，鑒定陽(yáng)性克隆后提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)和基因敲除細(xì)胞系的篩選

當(dāng)H9c2細(xì)胞密度為80%時(shí)，以1 600 V、10 ms、1 pulse電轉(zhuǎn)模式進(jìn)行電轉(zhuǎn)，回收質(zhì)粒稀釋液，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，加入嘌呤霉素至終濃度為2 μg/mL，10 d后挑取單克隆至96孔板，用胰酶消化單克隆陽(yáng)性細(xì)胞，單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)后，按照基因組提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，用相應(yīng)的鑒定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序。

1.7 免疫印跡

用免疫印跡法檢測(cè)GLP-1R蛋白表達(dá)情況。用培養(yǎng)皿分別培養(yǎng)GLP-1R-/-組及WT組H9c2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度為80%時(shí)收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜(聚偏氟乙烯)，加入一抗GLP-1R(1:1 000)/GADPH (1:5 000)4 ℃ 孵育過(guò)夜，二抗山羊抗兔(1:10 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。

1.8 細(xì)胞骨架染色和MMP測(cè)量

用F-actin對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。將WT組和GLP-1R-/-組H9c2心肌細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)接種于底部放置有蓋玻片的6孔板中，24 h后用F-actin進(jìn)行細(xì)胞骨架染色，Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，具體方法參考試劑盒說(shuō)明書。用JC-1熒光法測(cè)定MMP。將GLP-1R-/-和WT組H9c2細(xì)胞分別接種于放置有蓋玻片的6孔板(2×105個(gè)/孔)24 h，饑餓處理16 h，用MGO(0 μmol/L，50 μmol/L)刺激1 h后用JC-1進(jìn)行線粒體染色，具體方法參考試劑盒說(shuō)明書。電子熒光顯微鏡下拍照，PS軟件測(cè)量細(xì)胞面積及JC-1熒光面積，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用QRT-PCR檢測(cè)H9c2細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3和GLO1的mRNA表達(dá)水平。將GLP-1R-/-和WT組H9c2細(xì)胞分別接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)24 h，饑餓處理16 h后再用0 μmol/L、50 μmol/L MGO處理細(xì)胞24 h。Trizol試劑提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Bax、Bcl-2、caspase-3 、GLO1和GAPDH引物序列如下：Bax，forward 5’-GATCAGCTCGGGCACTTTA-3’：reverse 5’-TGTTTGCTGATGGCAACTTC-3’；BCl-2，forward 5’-CCGGGAGAACAGGGTATGATAA-3’；reverse 5’-CCCACTCGTAGCCCCTCTG-3’；caspase-3，forward 5’-AACGGACCTGTGGACCTGAA-3’；reverse 5’-TCAATACCGCAGTCCAGCTCT-3’；GLO1，forward 5’-GAAGCCTGATGATGGGAAAA-3’；reverse 5’-TCTCAGCATCTCGAATCACG-3’；GAPDH，forward 5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’；reverse 5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。Bax、Bcl-2、caspase-3 和GLO1的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。Bax、Bcl-2、caspase-3 和GLO1的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Cq法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9產(chǎn)生GLP-1R-/- H9c2細(xì)胞

將4條gRNA同時(shí)轉(zhuǎn)染，最終#B9細(xì)胞株被證實(shí)為陽(yáng)性克隆。菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，F(xiàn)1/R1顯示#B9較野生型細(xì)胞缺失295 bp，F(xiàn)1/R2顯示#B9較野生型細(xì)胞缺失601 bp(表2和圖2)。菌落鑒定得到的陽(yáng)性克隆安排質(zhì)粒小提并將小提質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果分析顯示，#B9細(xì)胞株等位基因1有296 bp缺失、2 bp發(fā)生移碼，等位基因2有295 bp缺失、3 bp發(fā)生移碼，表明#B9細(xì)胞株屬于雜合突變(圖3)。免疫印跡結(jié)果顯示，WT組細(xì)胞表達(dá)GLP-1R蛋白，而GLP-1R-/-組細(xì)胞GLP-1R蛋白表達(dá)缺失(圖4)。結(jié)果表明，WT H9c2心肌細(xì)胞表達(dá)GLP-1R蛋白，GLP-1R表達(dá)缺失的GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞構(gòu)建成功。

表2 PCR鑒定引物

注:M表示相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物,1表示#B9細(xì)胞株鑒定引物F1/R1,2表示W(wǎng)T H9c2細(xì)胞株鑒定引物F1/R1,3表示#B9細(xì)胞株鑒定引物F1/R2,4表示W(wǎng)T H9c2細(xì)胞株鑒定引物F1/R2。

注:A表示等位基因1,B表示等位基因2。

圖4 H9c2細(xì)胞GLP-1R蛋白的表達(dá)

2.2 GLP-1R-/- H9c2細(xì)胞形態(tài)

構(gòu)建GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞模型后，筆者通過(guò)細(xì)胞染色觀察GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核改變。圖5A顯示W(wǎng)T H9c2細(xì)胞組呈現(xiàn)舒張狀態(tài)形態(tài)較為多樣；GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞偽足收縮，形態(tài)更趨向于圓形。圖5B PS軟件測(cè)量細(xì)胞表面積分析表明，GLP-1R-/-組細(xì)胞表面積明顯小于WT組。

注:Merge,細(xì)胞骨架及細(xì)胞核染色合成圖;Hoechst,細(xì)胞核染色;Actin-Tracker,細(xì)胞骨架染色。**表示與WT組對(duì)比,P<0.01(n=36)。

2.3 GLP-1R抑制MGO誘導(dǎo)的H9c2凋亡

用CCK-8試劑檢測(cè)MGO對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響。如圖6A顯示，MGO濃度為0～40 μmol/L時(shí)對(duì)WT組H9c2細(xì)胞未顯示出細(xì)胞毒性作用，然而GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞活力卻顯著下降。MGO以劑量依賴的方式降低H9c2心肌細(xì)胞的存活率，并且MGO的細(xì)胞毒性在GLP-1R-/-H9c2中表現(xiàn)更為突出。此外，GLP-1R-/-組較WT組H9c2細(xì)胞在經(jīng)過(guò)隔夜饑餓處理后，細(xì)胞活力顯著下降。用60 μmol/L的MGO干預(yù)24 h后，WT組H9c2細(xì)胞存活率約為45%，而GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞存活率約為14%。40 μmol/L的MGO干預(yù)24 h后，WT組H9c2細(xì)胞存活率約為92%，而GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞存活率約為60%，因此，選用50 μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖6B所示，兩組細(xì)胞在同等濃度MGO(50 μmol/L)干預(yù)下，細(xì)胞活力呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降，且GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞對(duì)MGO的耐受性更差。

注:*表示與0 μmol/L組內(nèi)對(duì)比,P<0.05;**表示與0 μmol/L組內(nèi)對(duì)比,P<0.01;##表示與相同干預(yù)濃度組間對(duì)比,P<0.01(n=3)。

2.4 MGO造成線粒體功能障礙

用JC-1檢測(cè)MMP以評(píng)價(jià)MGO對(duì)H9c2細(xì)胞線粒體的影響。發(fā)射波長(zhǎng)比為590 nm:530 nm。如圖7A所示，H9c2細(xì)胞在MGO (50 μmol/L)孵育1 h后綠色熒光顯著增強(qiáng)，線粒體功能障礙，且GLP-1R-/-組較WT組H9c2細(xì)胞更為顯著。PS軟件測(cè)定紅綠熒光比值，如圖7B，MMP在MGO(50 μmol/L)孵育1 h后開(kāi)始顯著降低，表明MMP去極化，提示線粒體功能障礙，MMP的這種下降可能進(jìn)一步觸發(fā)細(xì)胞凋亡(與對(duì)照組相比P<0.01)。

注:Merge,紅色熒光及綠色熒光合成圖;Green,綠色熒光;Red,紅色熒光。##表示與50 μmol/L WT組對(duì)比,P<0.01(n=3)。

2.5 GLP-1R可阻止MGO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞線粒體凋亡通路

如圖8A、8B和8C所示，在50 μmol/L MGO干預(yù)24 h后，兩組細(xì)胞的Bax、caspase-3 mRNA表達(dá)水平相比于各對(duì)應(yīng)空白組有顯著升高(P<0.05)。此外，GLP-1R-/-組的Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。其中，兩組空白對(duì)照組Bax、caspase-3和Bcl-2 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。但MGO干預(yù)24 h后，GLP-1R-/-組Bax mRNA表達(dá)水平顯著高于WT組，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著低于WT組。如圖8D所示，兩組細(xì)胞在50 μmol/L MGO干預(yù)24 h后GLO1 mRNA表達(dá)水平相比于各對(duì)應(yīng)的空白組顯著降低(P<0.05)，與WT組相比，GLP-1R-/-組GLO1 mRNA表達(dá)水平降低更明顯。

注:*表示與0 μmol/L組內(nèi)對(duì)比,P<0.05;**表示與0 μmol/L組內(nèi)對(duì)比,P<0.01;##表示與相同干預(yù)濃度組間對(duì)比,P<0.01(n=3)。

3 討論

在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)GLP-1R蛋白表達(dá)缺失會(huì)影響H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)。揭示了GLP-1R在抑制MGO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。GLP-1R具抗凋亡作用，包括通過(guò)抑制線粒體凋亡通路激活和解毒系統(tǒng)GLO1表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抗凋亡作用。

DCM是一種特異性心肌病，指糖尿病患者在無(wú)其他心血管疾病的情況下發(fā)生的心功能障礙，而氧化應(yīng)激的增加與炎癥途徑的激活會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙[2]。MGO能修飾細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸，使細(xì)胞功能發(fā)生改變[25]。在心肌細(xì)胞中，MGO使硫氧還蛋白發(fā)生糖基化，使其抗凋亡功能受到抑制，進(jìn)而加重了心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷[26]。MGO的積累增加氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)線粒體功能障礙，促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡[10]。本研究通過(guò)CCK-8檢測(cè)MGO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力，MGO使H9c2心肌細(xì)胞活力顯著下降，這一現(xiàn)象與Nuamnaichati等[10]用1 mmol/L MGO干預(yù)H9c2細(xì)胞24 h后通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力顯著下降的研究結(jié)果一致，證明MGO在DCM發(fā)展中扮演著重要角色。此外，Nuamnaichati等[10]的研究還證實(shí)MGO使H9c2細(xì)胞活性氧產(chǎn)生顯著增加和線粒體功能障礙，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，GLP-1R激動(dòng)劑exendin-4通過(guò)cAMP/Epac/PI3K/Akt信號(hào)通路在H9c2細(xì)胞中表現(xiàn)出抗氧化和抗凋亡作用。

GLP-1R信號(hào)通路的激活通過(guò)凋亡減輕、氧化應(yīng)激減弱和能量代謝改善等發(fā)揮心肌保護(hù)作用[18-21]。然而，這些基于細(xì)胞水平的GLP-1R依賴的心肌細(xì)胞保護(hù)通路的研究均忽略了人體內(nèi)GLP-1短暫的半衰期。另一方面，GLP-1R的表達(dá)在不同物種和不同個(gè)體之間存在差異，并且檢測(cè)方法的敏感性和特異性仍有待提高，因此GLP-1R在心臟的精確定位存在困難[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡證實(shí)了WT H9c2細(xì)胞表達(dá)GLP-1R蛋白。

CRISPR/Cas9是依賴RNA識(shí)別DNA的基因編輯工程技術(shù)，通過(guò)改變與Cas9相關(guān)的gRNA的序列產(chǎn)生DNA位點(diǎn)斷裂[27]。多個(gè)不同的gRNA和Cas9進(jìn)行編程產(chǎn)生多次中斷，剪掉染色體的大片段刪除目的基因。本研究以GLP-1R基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞系構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)首次基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)GLP-1R-/-組相比于WT組，H9c2心肌細(xì)胞面積顯著減小，并且細(xì)胞形態(tài)呈圓形。DCM患者心臟脂肪酸/葡萄糖氧化代謝失衡，而GLP-1R可介導(dǎo)這種能量代謝失衡恢復(fù)。GLP-1處理離體心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞的葡萄糖利用率顯著升高[28]。本研究表明，對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行1%低血清隔夜饑餓處理后，GLP-1R缺乏，H9c2細(xì)胞凋亡率較WT顯著升高。筆者推測(cè)GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞顯著減小，與細(xì)胞能量代謝受損相關(guān)。

本研究通過(guò)梯度MGO干預(yù)GLP-1R-/-組及WT組H9c2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，同等濃度MGO干預(yù)24 h，GLP-1R-/-組的細(xì)胞活力顯著低于WT組。當(dāng)MGO的濃度為50 μmol/L時(shí)，能使細(xì)胞活力顯著下降。在MGO干預(yù)后，兩組細(xì)胞的活力呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降，并且在相同時(shí)間同等濃度干預(yù)下，GLP-1R-/-組細(xì)胞活力較WT組低。與神經(jīng)細(xì)胞相比，心肌細(xì)胞在更低濃度MGO干預(yù)下即出現(xiàn)了明顯的損傷，表明心肌細(xì)胞對(duì)于MGO有著更低的耐受力。GLP-1R-/-組H9c2細(xì)胞較WT組H9c2細(xì)胞更為脆弱，這也印證了GLP-1R的心肌保護(hù)作用。

線粒體途徑就是內(nèi)源性凋亡途徑，在應(yīng)對(duì)刺激損傷因素時(shí)，Bcl-2被抑制，Bax和Bak被激活，凋亡基因與抗凋亡基因的表達(dá)失衡使線粒體膜通透性發(fā)生改變，線粒體釋放細(xì)胞色素c，級(jí)聯(lián)下游含半胱氨酸的caspase造成細(xì)胞成分的切割，促使細(xì)胞死亡[7]。Bcl-2家族是一組包含了抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-W)和促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bad和Bid)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白[29]。當(dāng)細(xì)胞面臨各種應(yīng)激時(shí)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白表達(dá)的改變?cè)诩?xì)胞存活中發(fā)揮重要作用。應(yīng)激條件下，細(xì)胞質(zhì)中的Bax更多錨定至線粒體外膜上并與Bak形成二聚體，最終線粒體外膜上會(huì)形成脂質(zhì)孔，導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體釋放及與凋亡激活因子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，同時(shí)Bcl-2凋亡抑制作用受阻。艾塞那肽刺激GLP-1R通過(guò)Epac減弱了H2O2誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生、減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量、抑制caspase-3活性和增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用[20]。在本研究中，GLP-1R-/-組H9c2細(xì)胞受MGO刺激后MMP較WT組顯著下降，線粒體發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷。此外筆者還觀察到MGO打破了Bcl-2與Bax之間的平衡，并且這種失衡在GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞中更為突出，這些數(shù)據(jù)印證了GLP-1R通過(guò)抑制MGO誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用。caspase-3切割關(guān)鍵的細(xì)胞蛋白，導(dǎo)致經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞發(fā)生典型的形態(tài)學(xué)變化[30]。目前本研究表明，MGO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)上調(diào)，并且在GLP-1R缺失的心肌細(xì)胞中更為顯著。

MGO會(huì)在細(xì)胞和細(xì)胞外蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA上快速生成糖基化加合物，進(jìn)而改變其生物學(xué)功能[11]。MGO對(duì)蛋白質(zhì)的修飾可造成細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)的功能喪失、交聯(lián)以及細(xì)胞功能紊亂[31]。GLP-1R是經(jīng)典的7次跨膜受體，MGO干預(yù)下GLP-1R對(duì)細(xì)胞的保護(hù)功能可能受到干擾[32-33]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)梯度MGO干預(yù)心肌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率表現(xiàn)為顯著的濃度依賴性，也證實(shí)了MGO可造成顯著的細(xì)胞功能紊亂，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。而在組間對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，GLP-1R缺失心肌細(xì)胞呈現(xiàn)更高的凋亡率。另有研究[34]發(fā)現(xiàn)，將MGO加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，MGO定量地被轉(zhuǎn)化為D-乳酸，證實(shí)了胞外的MGO進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行解毒。細(xì)胞內(nèi)的脫毒系統(tǒng)主要是GLO系統(tǒng)[11]。有研究[22]表明，糖尿病患者脂肪組織中GLO1的活性降低，利拉魯肽提高了GLO1的活性。因此，GLP-1R可能通過(guò)改善GLO1的活性及表達(dá)來(lái)增強(qiáng)對(duì)MGO的代謝，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)與空白組比較，MGO干預(yù)組GLO1 mRNA表達(dá)顯著降低。GLO1表達(dá)量的下調(diào)使MGO的解毒能力受到限制，造成MGO在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，MGO進(jìn)一步通過(guò)糖基化作用導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，加速了細(xì)胞凋亡。雖然50 μmol/L MGO干預(yù)24 h后GLP-1R-/-組及WT組GLO1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異，但GLP-1R-/-組GLO1 mRNA整體趨勢(shì)低于WT組。因此，GLP-1R缺失可能通過(guò)影響GLO1表達(dá)，細(xì)胞對(duì)MGO解毒能力下降，進(jìn)而影響細(xì)胞的存活率。

總之，本研究成功構(gòu)建了GLP-1R-/-H9c2細(xì)胞系。一方面印證了GLP-1R缺失加劇了MGO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞促凋亡信號(hào)Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡信號(hào)Bcl-2的表達(dá)，開(kāi)啟線粒體凋亡通路進(jìn)一步級(jí)聯(lián)下游切割caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面證實(shí)GLP-1R缺失會(huì)抑制MGO解毒系統(tǒng)關(guān)鍵酶GLO1的表達(dá)，進(jìn)而加劇MGO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡，這些數(shù)據(jù)均強(qiáng)調(diào)了GLP-1R的心臟保護(hù)作用。