野生多花蘭組培苗的馴化研究

文 雯 唐映紅， 伍 茗 李佳娜 龍 圓

（1.湖南文理學院/生命與環(huán)境科學學院，湖南 常德 415000；2.湖南常德市人工智能與生物醫(yī)藥研究中心，湖南 常德 415000；3.湖南常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心，湖南 常德 415000）

多花蘭（Cymbidium floribundum）又稱蜜蜂蘭，是蘭科蘭屬的一種附生植物，是《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄二物種中的一員，是國家Ⅱ級保護野生植物。多花蘭葉革質(zhì)肥厚，具有光澤，花芽易分化，花朵多達40朵以上，色澤鮮艷，花期長，具有較高的觀賞價值。多花蘭具有藥用價值：其根可作為藥用，滋陰清肺，化痰止咳。多花蘭株型、花朵數(shù)及花色等方面均有豐富的變異，能耐高溫和低溫，《國際蘭花新品種名錄（New Orchid Hy-brids）》和國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蘭屬原生種的雜交利用情況顯示多花蘭雜種數(shù)量均排在前5名，其在新品種培育中具有重要應用價值。

目前，我國栽培的國蘭品種絕大多數(shù)都是由野生種類引種馴化而來。多花蘭的繁殖多以分株繁殖為主，繁殖速度較慢，且蘭科種子很小，內(nèi)含一些發(fā)育不完全的球形胚，無胚乳，自然狀態(tài)下很難萌發(fā)。因此，由于大量的野地采挖，造成多花蘭資源的巨大破壞和浪費。自種子無菌萌發(fā)技術如建蘭（Cymbidium ensifolium）、蕙蘭（Cymbidium faberi）等獲得成功后，已建立起蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）等的快繁體系，部分品種已達到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段，大大帶動整個蘭花的產(chǎn)業(yè)化。

本研究前期建立了野生多花蘭種子無菌萌發(fā)形成原球莖、原球莖增殖和出芽、芽生根的組織培養(yǎng)快繁體系，不僅保存了其種質(zhì)資源，而且獲得了大量的野生多花蘭組培苗。因此，本研究以該野生多花蘭組培苗為材料，研究不同營養(yǎng)液和不同基質(zhì)對組培苗馴化成活和生長的影響，旨在研究出簡易便于推廣的多花蘭組培苗馴化方案，為多花蘭種苗工廠化生產(chǎn)提供基礎，對多花蘭野生資源的保護和回歸、建立多花蘭無土農(nóng)業(yè)或發(fā)展多花蘭都市農(nóng)業(yè)均具有重要意義。

1.材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為野生多花蘭組培苗。

1.2 不同營養(yǎng)液對多花蘭組培苗的馴化研究

當多花蘭組培苗長至5-6 cm時，打開組培瓶瓶蓋，洗凈植株根部固體培養(yǎng)基，轉接到13組不同營養(yǎng)液中進行馴化（簡稱馴化苗1）。營養(yǎng)液分別為稀釋不同倍數(shù)的1/2MS（Murashige and Skoog）、1/4MS、1/8MS和花寶一號（Hyponex， HP），自來水為對照，將營養(yǎng)液EC值控制在2.0-3.5 mmhos·cm-1間，pH值在5.4-6.0，不含瓊脂和蔗糖。采用靜止式水培，即將組培苗插在泡沫盤的孔內(nèi)固定住植株，再將泡沫盤放入裝有營養(yǎng)液的水培箱中，使其漂浮在水培箱中，根浸在營養(yǎng)液中，每個處理組48株，重復2次。在75%蔭蔽處培養(yǎng)，溫度為20-26℃，平均每7 d更換1次營養(yǎng)液，若蒸騰作用過大則適當加蒸餾水。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計馴化成活率，成活率（%）=（成活植株數(shù)/總植株數(shù)）×100，每個處理組隨機抽取5株測量其根長和最長葉長表示株高。

1.3 不同基質(zhì)對多花蘭組培苗的馴化研究

當多花蘭組培苗長至5-6 cm時，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，組培溫室內(nèi)培養(yǎng)3 d；再加水室溫室內(nèi)培養(yǎng)3 d；然后洗凈植株根部固體培養(yǎng)基，用500倍多菌靈消毒植株根部15 s備用（簡稱馴化苗2）。將馴化苗1和2移栽到6組不同基質(zhì)中培養(yǎng)，每組移栽48株，重復2次，移栽之后澆透水，在75%蔭蔽處培養(yǎng)，溫度為20-26℃。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計成活率，成活率（%）=移栽成活株數(shù)/移栽總株數(shù)×100。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤表示，采用SPSS 26.0軟件進行方差分析，采用新復極差法進行多重比較。

2.結果與分析

2.1 不同營養(yǎng)液對馴化苗成活的影響

方差分析結果顯示（表1），不同營養(yǎng)液對馴化苗成活的影響表現(xiàn)出極顯著差異。通過多重比較可以看出（表2），處理組2和處理組4馴化苗的成活率分別為98.96%和95.29%，顯著高于其他處理組；其次是處理組10的馴化苗成活率為85.46%，顯著高于其他處理組；處理組1的馴化苗成活率最低，為21.17%，且顯著低于對照組馴化苗的成活率39.71%。處理組2（圖1）和處理組4（圖2）馴化前隨機選取的5株組培苗培養(yǎng)60 d后全部成活，并且株高伸長，葉片深綠色，生長狀況良好。

圖1 1/2 MS（稀釋500倍）馴化前后苗生長情況（處理組2）

圖2 1/4 MS（稀釋50倍）馴化前后苗生長情況（處理組4）

表1 不同營養(yǎng)液對馴化苗成活的方差分析

表2 不同營養(yǎng)液對馴化苗成活與生長的影響（培養(yǎng)60 d）

11 HP 5000．23±0．11 de 0．39±0．27 ab 79．38±1．88 c 12 HP 10000．75±0．17 bc 0．18±0．40 b 57．92±0．42 e 13 water CK -0．07±0．09 e 0．04±0．12 b 39．71±0．71 f

同列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），下同

2.2 不同營養(yǎng)液對馴化苗根生長的影響

方差分析結果顯示（表3），不同營養(yǎng)液對馴化苗根生長的影響表現(xiàn)出極顯著差異。通過多重比較可以看出（表2），組培苗移栽入處理7營養(yǎng)液中培養(yǎng)60 d根平均伸長1.86 cm，顯著高于其他處理；處理5、處理9、處理10營養(yǎng)液中培養(yǎng)60 d后根平均伸長均約為1 cm；稀釋50倍的1/2MS營養(yǎng)液和自來水中苗的根沒有生長，根腐爛反而使根長減短。

表3 不同營養(yǎng)液對馴化苗根生長的方差分析

馴化后所有處理組（除處理組1和13外）中苗的根均有伸長，但許多小根發(fā)生腐爛使根的數(shù)量均減少（圖3A，以處理組7為例作圖），馴化前淺綠色的根（圖3B）經(jīng)馴化后均變成深綠色或棕色根（圖3A）。

圖3 1/8 MS（稀釋50倍）馴化前后苗根生長情況（處理7）

2.3 不同營養(yǎng)液對馴化苗生長的影響

方差分析結果顯示（表4），不同營養(yǎng)液對馴化苗生長的影響表現(xiàn)出顯著差異。通過多重比較可以看出（表2），馴化苗株高伸長較多的是處理組2（圖1）和處理組7（圖3），均伸長約0.9 cm；馴化苗株高幾乎沒有變化的是處理組1、9和13；所有處理組均有少量外側葉片黃化脫落，也有新葉片形成，中心葉片均有不同程度的伸長，所有葉片顏色由馴化前的淺綠色變成深綠色，葉片變得較馴化前硬（圖1）。

表4 不同營養(yǎng)液對馴化苗生長的方差分析

2.4 不同基質(zhì)對馴化苗成活的影響

將在稀釋500倍的1/2MS營養(yǎng)液中培養(yǎng)60 d的馴化苗1（圖4A），以及馴化苗2（圖4B）轉移到6組不同基質(zhì)中培養(yǎng)。方差分析結果顯示（表5），不同基質(zhì)對馴化苗成活的影響表現(xiàn)出極顯著差異，馴化苗1和2在不同基質(zhì)中的成活也表現(xiàn)出顯著差異。多重比較結果顯示（表6），馴化苗1和2移栽入基質(zhì)6（林下腐殖土：風化石=3∶1， v/v）中培養(yǎng)60 d的成活率分別約為88%和99%，顯著高于其他基質(zhì)（基質(zhì)2除外）；整體來看，成活率較高的是含有腐殖土的基質(zhì)，顯著高于不含腐殖土的基質(zhì)；不同基質(zhì)中馴化苗1的成活率顯著高于馴化苗2。綜上所述，獲得的最優(yōu)多花蘭組培苗馴化基質(zhì)為林下腐殖土：風化石=3∶1（v/v），在該基質(zhì)中培養(yǎng)60 d葉片明顯伸長，葉色翠綠，植株生長約1 cm（圖4C）。

表5 不同基質(zhì)對馴化苗成活的方差分析

表6 不同基質(zhì)對馴化苗成活的影響（培養(yǎng)60 d）

圖4 基質(zhì)6對多花蘭組培苗的馴化研究

3.討論

目前幾乎沒有采用營養(yǎng)液培養(yǎng)多花蘭相關的報道，其他蘭科植物多采用霍格蘭營養(yǎng)液配方、日本園試配方和楊少輝試驗配方或改變元素含量等相應改良的配方進行水培，伍成厚等采用改良楊少輝試驗配方培養(yǎng)100 d后的五唇蘭植株成活率為95.8%。本研究最優(yōu)營養(yǎng)液中（稀釋500倍的1/2MS營養(yǎng)液）培養(yǎng)60 d后的馴化苗成活率可達99%，苗增高0.91 cm，優(yōu)于周啟貴等采用的營養(yǎng)液培養(yǎng)春蘭的株高增量。本研究采用的稀釋50倍的1/8MS營養(yǎng)液可使馴化苗根伸長1.86 cm、苗增高0.92 cm，優(yōu)于其他蘭科研究所采用的營養(yǎng)液。本研究結果顯示兩種不同濃度的大量元素對馴化苗的成活和根的生長存在差異，但生長差異不顯著。若要獲得成活率高的馴化苗則采用稀釋500倍的1/2MS營養(yǎng)液，若要獲得根生長較多的馴化苗則采用稀釋50倍的1/8MS營養(yǎng)液。因此，本研究獲得的最適營養(yǎng)液是延用組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，對提高組培苗馴化成活具有一定的作用，后期選擇經(jīng)稀釋500倍的1/2MS營養(yǎng)液馴化60 d的苗，移栽入基質(zhì)中繼續(xù)馴化培養(yǎng)，提高最終的田間移栽成活率。

本研究獲得的最優(yōu)多花蘭組培苗的馴化基質(zhì)為林下腐殖土：風化石=3∶1（v/v），此基質(zhì)模擬野生多花蘭的生長環(huán)境，效果優(yōu)于其他無土基質(zhì)。馴化苗2在該基質(zhì)中培養(yǎng)60 d成活率達88%，但成活率都較低于已報到的其他蘭科植物，如碎火磚塊：腐質(zhì)土=1∶1（v/v）的基質(zhì)培養(yǎng)50 d后的成活率達90%，草炭：珍珠巖：火山石=3∶3∶4（v/v/v）基質(zhì)中培養(yǎng)60 d后成活率達到96%；本研究經(jīng)前期營養(yǎng)液馴化60 d后的馴化苗1，在該基質(zhì)中培養(yǎng)60 d成活率高達99%，優(yōu)于已報到的多花蘭或其他蘭科移栽成活率。本研究使用腐殖土基質(zhì)的成活率高于其他基質(zhì)的，可能是因為腐殖土成分與野外的林下腐殖土成分接近。

4.結論

本研究不僅獲得了多花蘭組培苗成活率高達99%的營養(yǎng)液馴化方案，而且將經(jīng)該營養(yǎng)液培養(yǎng)60 d后的馴化苗轉移至基質(zhì)中培養(yǎng)60 d，成活率也高達99%。既可采用營養(yǎng)液單獨馴化，也可采用營養(yǎng)液結合基質(zhì)馴化，整個馴化過程可在2-4個月內(nèi)完成。該馴化方案簡易便于推廣，有利于多花蘭野生資源的保護和回歸，對建立多花蘭種苗工廠化、多花蘭無土農(nóng)業(yè)或發(fā)展多花蘭都市農(nóng)業(yè)均具有重要意義。