楊梅肉蔥病發(fā)生過程果肉內(nèi)源激素與營(yíng)養(yǎng)元素的含量分析

顏麗菊，趙慧宇，蔣 芯，朱瀟婷，尤建林

(1 浙江省臨海市特產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江臨海，317000；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，杭州，310021；3 浙江省農(nóng)藥殘留檢測(cè)與控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州，310021；4 浙江省臺(tái)州市種植業(yè)推廣中心，浙江臨海，317000)

楊梅肉蔥病是果實(shí)生長(zhǎng)期最主要的病害之一，在浙江省、福建省等楊梅產(chǎn)區(qū)發(fā)病率高，2007年福建省楊梅產(chǎn)區(qū)永定縣肉蔥病率大于50%，2018年福安市楊梅肉蔥病率超過40%[1]。近幾年，筆者在浙江省楊梅產(chǎn)區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，楊梅肉蔥病以東魁發(fā)病較重，發(fā)病率30%～50%。楊梅肉蔥病主要發(fā)生在硬核期至果實(shí)轉(zhuǎn)色前，發(fā)病時(shí)果實(shí)肉柱外凸，果核外露變褐，有的畸形或脫落[2-3]，因此嚴(yán)重影響楊梅產(chǎn)量、外觀和品質(zhì)。目前，楊梅肉蔥病發(fā)病原因尚無定論，推測(cè)是楊梅自身生理因素導(dǎo)致，少量報(bào)道認(rèn)為是果實(shí)中病菌或蟲害引起[2-4]。

調(diào)研發(fā)現(xiàn)，楊梅肉蔥病的發(fā)生與品種、氣候及栽培管理水平密切相關(guān)。從品種看，主栽品種中東魁楊梅發(fā)病率最高；從氣候方面看，硬核期隨著降雨量增加，肉蔥病發(fā)病率上升；從管理水平看，樹體管理粗放、樹勢(shì)衰弱、營(yíng)養(yǎng)不均衡、元素虧缺的果園發(fā)病較重[1]。另外，桃在硬核期也容易出現(xiàn)因果肉膨大過快，拉力過大造成的果核開裂問題，這與楊梅肉蔥病發(fā)病特點(diǎn)極為相似。除了品種因素外，硬核期凡能促進(jìn)果實(shí)增長(zhǎng)的措施均易引發(fā)裂核；如硬核期降雨、大量灌水、過量施肥、過早疏果、施用膨果劑、設(shè)施內(nèi)溫度驟變、營(yíng)養(yǎng)元素缺乏等[5]。研究表明，果樹硬核期需要多種營(yíng)養(yǎng)元素(磷、鉀和鈣)完成這一過程，雖然需要充足營(yíng)養(yǎng)，但大量肥料尤其氮肥的大量施用，也會(huì)加劇肉蔥病的發(fā)生。此外，內(nèi)源激素與梨幼果萼片脫落、表面凸起和裂果有相關(guān)性[6-7]。因此，為了探究楊梅肉蔥病發(fā)生的生理原因，我們選擇歷年來?xiàng)蠲啡馐[病發(fā)生較嚴(yán)重的東魁楊梅為試材，檢測(cè)果實(shí)內(nèi)源激素及營(yíng)養(yǎng)元素含量，探究楊梅肉蔥病發(fā)生的影響因素，為合理防治該病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

脫落酸、赤霉酸、茉莉酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司，水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自源葉公司，氘代赤霉酸、氘代脫落酸、氘代水楊酸、氘代吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自O(shè)lchemim公司，CNW C18QuEChers填料購(gòu)自上海安譜公司，色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自德國(guó)默克公司，分析純硫酸、氫氧化鈉、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠指示劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(北京)，純凈水用Milli-Q(美國(guó)Millipore公司產(chǎn))制備。

梅特勒LE204E型萬分之一天平、FA1204電子天平，上海衡際科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；TG-16G臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；水浴氮吹儀，上海那艾儀器有限公司產(chǎn)；CHA-2氣浴恒溫?fù)u床，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品公司產(chǎn)；PS40A超聲清洗儀，深華泰科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；SKD-20S2消化爐、SKD-100型自動(dòng)凱式定氮儀、DB-2EFS石墨電熱板、ICPMS X-2電感耦合等離子體質(zhì)譜，美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)；SCIEX-6500QTRAP液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，美國(guó)AB公司產(chǎn)；AGLIENT1290高效液相色譜儀、AGLIENT 7890B-5977氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)AGLIENT公司產(chǎn)。

1.2 樣品采集

以浙江省臨海市括蒼鎮(zhèn)長(zhǎng)潭村20年生東魁楊梅園供試，東經(jīng)120.96°，北緯28.88°，海拔70 m，砂壤土，pH值5.3，有機(jī)質(zhì)平均含量1.8%，土層30～40 cm，肥力偏低。管理水平中等，一般一年施采后肥和壯果肥各1次，采后肥以中氮高鉀復(fù)合肥為主，壯果肥以低氮高鉀復(fù)合肥為主。一年修剪2次，即采后和冬季各1次。掛果多的年份，幼果期適當(dāng)疏果，使其掛果合理。該楊梅園歷年肉蔥病發(fā)病較重，近3年發(fā)病率50%～65%。

采樣方法：于楊梅肉蔥病發(fā)病前(2020年4月27日)，發(fā)病初期(2020年5月8日，即硬核初期)和發(fā)病中后期(2020年5月18日，即硬核期)采樣各1次。調(diào)研發(fā)現(xiàn)同一株楊梅肉蔥病在樹冠底部(尤其是下坡樹冠底部)發(fā)病較重，樹冠中上部(特別是上坡樹冠頂部)發(fā)病較輕或不發(fā)病。為了減少差異，同一株采集正常果與病果，第1次在發(fā)病前(即果實(shí)肉蔥病癥狀還未出來)分別采集樹冠頂部和樹冠底部正常果實(shí)，第2次、第3次分別采集樹冠頂部正常果實(shí)、樹冠底部的發(fā)病果實(shí)和正常果實(shí)各10～15個(gè)，選擇了3株樹齡、長(zhǎng)勢(shì)、掛果、發(fā)病情況接近的楊梅作為重復(fù)。取樣后立即將果實(shí)裝入PE離心管內(nèi)貼好標(biāo)簽，并迅速放入液氮速凍，干冰運(yùn)輸，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分析測(cè)定方法

全氮、磷、鉀含量分別采用改良凱氏定氮法、鉬藍(lán)比色法和火焰光度計(jì)測(cè)定，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[8]；鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、錳(Mn)、銅(Cu)、鋅(Zn)、硼(B)、鉬(Mo)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]的方法。采用高效液相色譜與質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)聯(lián)用的方法測(cè)定果實(shí)吲哚乙酸、吲哚丁酸、脫落酸、赤霉素、茉莉酸、水楊酸等6種內(nèi)源激素含量，具體試驗(yàn)步驟參照龍偉等[10]和陳千思等[11]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007和SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)內(nèi)源激素含量變化

從圖1可以看出，發(fā)病前，樹冠頂部和底部果實(shí)中6種激素的含量，除赤霉素差異顯著外，其他均無顯著差異，其中頂部果實(shí)赤霉素平均含量為0.005 ng/g，顯著低于底部正常果平均含量0.021 ng/g。

注：發(fā)病前，發(fā)病初期和發(fā)病中期分別對(duì)應(yīng)2020年4月27日、5月8日(硬核初期)、5月18日(硬核期)。圖2同。

發(fā)病初期，樹冠底部正常果和樹冠底部病果中，只有茉莉酸和吲哚丁酸含量差異顯著，其他激素含量差異不顯著。其中，病果茉莉酸平均含量為60.1 ng/g，顯著高于正常果平均含量13.3 ng/g；病果吲哚丁酸平均含量為0.37 ng/g，顯著高于正常果平均含量0.08 ng/g。正常果中，發(fā)病初期樹冠頂部和樹冠底部果除赤霉素、吲哚丁酸、脫落酸差異顯著外，其他均無顯著性差異。其中，頂部果赤霉素平均含量為0.045 ng/g，顯著高于底部果平均含量0.018 ng/g；頂部果吲哚丁酸平均含量為0.520 ng/g，顯著高于底部果平均含量0.080 ng/g；頂部果實(shí)脫落酸平均含量為113.3 ng/g，顯著低于底部果平均含量219.0 ng/g。發(fā)病中后期，樹冠底部正常果和樹冠底部病果中6種激素，除吲哚乙酸、脫落酸和水楊酸含量差異顯著外，其他均無顯著性差異。其中，病果吲哚乙酸平均含量為126.1 ng/g，顯著高于正常果平均含量40.4 ng/g；病果脫落酸平均含量為247.9 ng/g，顯著高于正常果平均含量65.8 ng/g；病果水楊酸平均含量為917.7 ng/g，顯著高于正常果平均含量354.0 ng/g。發(fā)病中后期，樹冠頂部和樹冠底部正常果6種激素含量均無顯著性差異。

2.2 果實(shí)營(yíng)養(yǎng)元素含量變化

從圖2可以看出，楊梅肉蔥病不同階段，病果與正常果中全氮、硼、銅、鐵、鎂、錳、鋅和鉬元素含量差別不大；而發(fā)病中后期，病果鈣、磷和鉀元素含量要略低于正常果。

圖2 楊梅肉蔥病不同發(fā)病階段東魁楊梅果實(shí)營(yíng)養(yǎng)元素含量變化

3 討論與結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，楊梅硬核期降雨、大量灌水、過量施肥、過早疏果、施用膨果劑、設(shè)施內(nèi)溫度驟變、營(yíng)養(yǎng)元素缺乏等均可以加劇肉蔥病發(fā)生。上述促進(jìn)果實(shí)增長(zhǎng)的生產(chǎn)管理措施和氣候條件導(dǎo)致了果肉快速增長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致果肉與果核分離。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病初期，病果中吲哚丁酸含量顯著高于正常果，說明病果實(shí)中不斷產(chǎn)生吲哚丁酸來加速細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂，加速了果肉生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致與果核發(fā)生分離。同時(shí)，果實(shí)中防御類激素茉莉酸的合成升高，茉莉酸具有類似脫落酸促進(jìn)果實(shí)成熟衰老的作用[12]，同時(shí)它作為植物內(nèi)源信號(hào)分子，在損傷信號(hào)途徑中能誘導(dǎo)多種防御基因的表達(dá)[13]。

發(fā)病中后期，病果中吲哚乙酸、脫落酸和水楊酸平均含量顯著高于正常果。吲哚乙酸在果實(shí)發(fā)育過程中主要起到促進(jìn)果實(shí)膨大和生長(zhǎng)的作用[14]。張雪等[15]對(duì)桃縫合線處局部凸出，過早軟化現(xiàn)象的研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)第二次膨大后期，桃發(fā)育障礙果中吲哚乙酸含量要顯著高于正常果。本試驗(yàn)中，肉蔥病發(fā)病中后期病果中吲哚乙酸含量顯著高于正常果，可能是導(dǎo)致肉蔥病果的肉柱膨大凸出的原因之一。脫落酸在果實(shí)發(fā)育過程中具有調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、促進(jìn)成熟衰老等效應(yīng)[16]。孟玉平等[17]研究認(rèn)為，蘋果果實(shí)進(jìn)入成熟階段后，脫落酸含量高，脫落酸/吲哚乙酸高和乙烯高會(huì)刺激離層組織中細(xì)胞壁分解酶的活性增高，進(jìn)而促進(jìn)離層形成，導(dǎo)致落果發(fā)生。防御類激素水楊酸在發(fā)病中后期病果中的含量顯著升高，這與果肉果核分離產(chǎn)生傷口而形成防御反應(yīng)一致。

果實(shí)硬核期需要磷、鉀和鈣等多種營(yíng)養(yǎng)元素，本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病中后期病果鈣、磷和鉀元素含量要略低于正常果，因此在硬核期應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充這些營(yíng)養(yǎng)元素。顏麗菊等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在楊梅謝花后至硬核期前噴施高鈣類肥料可以有效降低肉蔥病發(fā)生，與本研究結(jié)果一致。然而鈣、鉀和磷元素在肉蔥病發(fā)生過程中的作用機(jī)理，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，為了進(jìn)一步防控肉蔥病的發(fā)生，提高楊梅栽培管理水平十分重要，建議一方面在果實(shí)硬核前期及時(shí)補(bǔ)充磷、鉀和鈣肥，減少促進(jìn)果實(shí)膨大肥料和膨化劑的使用；另一方面避免硬核期大量灌溉導(dǎo)致果肉快速生長(zhǎng)，灌溉應(yīng)盡量選擇晴天，而大雨過后應(yīng)加強(qiáng)果園排水。