兩種竹蓀多糖含量測定方法的不確定度比較

陶秋云，何明先，張 鵬，鄧清月 ，郭 松

（1.金秀瑤族自治縣國有金秀林場，廣西 來賓 545799；2.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546199；3.廣西科技師范學(xué)院壯瑤藥品質(zhì)生物學(xué)重點實驗室，廣西 來賓 546199）

竹蓀（Dictyophora indusiata）為鬼筆科竹蓀屬真菌，又稱竹姑娘、仙人竹等.竹蓀是一種名貴的藥食兩用真菌，生于枯枝落葉和腐殖質(zhì)多的竹林或闊葉林中，主要分布在四川、云南、福建、臺灣和湖南等地，素有“真菌皇后”之稱［1-2］.竹蓀有著優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，食用后可以起到降血壓、降血脂［3］、抗氧化、補(bǔ)氣養(yǎng)陰［4］、抗炎［5］、免疫調(diào)節(jié)［6］等活性和藥理作用.目前，定量測定竹蓀多糖含量常見的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和高錳酸鉀滴定法［7］等.由于這幾種方法靈敏度各不相同，所以在一定濃度范圍內(nèi)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度也不同，而且在分析過程中都不可避免地存在誤差，此時不確定度的大小就發(fā)揮了重要作用.

測量不確定度是評定測量結(jié)果質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，是現(xiàn)代誤差理論的重要內(nèi)容之一.不確定度是用于確定檢測結(jié)果可信程度的重要指標(biāo)，與測量結(jié)果有關(guān)，并用來合理表征被測值離散度的重要參數(shù)［8-9］.如今，不確定度的測量越來越受到重視，在各行各業(yè)檢測過程中的應(yīng)用日益廣泛.目前，關(guān)于竹蓀的研究主要集中于苯酚-硫酸法［7，10］測定竹蓀多糖含量，而采用蒽酮-硫酸法測定竹蓀多糖含量的研究相對較少［11-12］.

本研究以竹蓀多糖提取物為研究對象，采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法兩種方法，利用紫外可見分光光度計分別測定竹蓀多糖，根據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》［13］對試驗過程中可能引入不確定度的各種因素進(jìn)行了分析，計算合成不確定度和擴(kuò)展不確定度，旨在為確定合理的竹蓀多糖含量測定方法提供依據(jù)，并在實驗室試驗過程中確保檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠程度提供參考價值.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水葡萄糖（分析純，產(chǎn)地為西隴科學(xué)股份有限公司）；竹蓀多糖提取物（西安寶益豐生物科技有限公司，多糖含量為70%）；苯酚（分析純，武漢長成化成科技發(fā)展有限公司）；硫酸（分析純，廉江市愛廉化試劑有限公司）；蒽酮（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）.

FA2004 電子分析天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；UV-5100 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）.

1.2 實驗方法

參照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的測定》［14］，稍作修改.準(zhǔn)確稱取10 mg 105℃干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL 容量瓶中，加適量蒸餾水溶解并定容至刻度，制備成0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻備用.

1.2.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取5 g 苯酚置于100 mL 棕色容量瓶中，加適量的蒸餾水溶解并定容至刻度線，搖勻備用.精密移取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL 的0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于編號為1 至7 的7 支10 mL 比色管中，分別加蒸餾水補(bǔ)足至2.00 mL 后，依次加入5%的苯酚溶液1.00 mL、濃硫酸5.00 mL，充分搖勻后室溫靜置6 min，然后放入水浴中反應(yīng)15 min.將1 至7 號管溶液依次置于紫外可見分光光度計中在波長490 nm 處測定吸光度A，將其為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.2 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照張妍、劉太林和林藝華的研究方法［11-12］，稍作修改.準(zhǔn)確稱取0.20 g 蒽酮置于100 mL 棕色容量瓶中，加適量硫酸溶液溶解并定容至刻度，混勻即可.

精密移取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL 的0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于編號為1 至7 的7 支10 mL 比色管中，分別加蒸餾水補(bǔ)足至2.00 mL后，依次加入蒽酮-硫酸溶液6.00 mL，充分搖勻后室溫靜置6 min，然后放入水浴中反應(yīng)15 min.將1 至7 號管溶液依次置于紫外可見分光光度計中在波長620 nm 處測定吸光度A，將其為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3 不確定度來源分析

1.3.1 A 類不確定度

測量竹蓀多糖提取物的重復(fù)性試驗.樣品重復(fù)性試驗中對測定值引入的不確定度，可采用統(tǒng)計分析法進(jìn)行評定.

1.3.2 B 類不確定度

不確定度的B類評定由以下方面引入：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、電子天平稱量、容量瓶允許誤差、移液器允許誤差、比色管允許誤差、實驗室溫度和紫外可見分光光度計以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度.

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Office Excel 2010 軟件完成數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計；并使用軟件Origin2018 繪制圖像.

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

參照張妍［10］、鐘巖［12］等人的方法，稍作修改.準(zhǔn)確稱取竹蓀多糖提取物10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加適量蒸餾水水溶解并稀釋至刻度，搖勻可得0.1 mg/mL 的竹蓀提取液；精密吸取0.6 mL，補(bǔ)加蒸餾水至2.0 mL，按“1.2.1”項、“1.2.2”項方法顯色、測定吸光度值.按下式計算：

式中：ω——樣品中竹蓀多糖含量，%；

D——比色管中竹蓀多糖提取物溶液的稀釋倍數(shù)；

C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中含糖量，單位為μg/mL；

V——所取竹蓀多糖提取物定容的體積，單位為mL；

M——竹蓀多糖提取物的質(zhì)量，單位為mg；

計算結(jié)果保留小數(shù)點后兩位.

2.2 測量不確定度的評定

整個測量過程中對測量結(jié)果引入的不確定度來源如圖1 所示.

圖1 測量不確定度來源因果圖Figure 1 Cause and effect diagram of uncertainty measurement source

結(jié)合化學(xué)分析JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，并從實驗的測定方法與步驟中分析，兩種竹蓀多糖含量測定方法的不確定度來源主要包括：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制過程中引入的不確定度；②樣品處理引入的不確定度；③紫外可見分光光度計引入的不確定度；④標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度；⑤樣品重復(fù)性引入的不確定度.

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制過程中的不確定度

2.2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

從該標(biāo)準(zhǔn)品證書中查得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的純度（99.6±0.5）%，為均勻分布，其k為計算，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為；其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.1.2 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，使用FA2004電子天平稱取0.1g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100mL容量瓶中，由檢定證書得到電子天平的最大允差是±0.1mg，取均勻分布計算，則電子天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：；其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定中，容量瓶引入的不確定度

實驗使用的容量瓶體積為100 mL（A等品），依據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃容器檢定規(guī)程》中查得允差為±0.1 mL，取均勻分布計算，則該容量瓶引入的不確定度為；20℃時水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，在實驗室中環(huán)境溫度變動為±5℃，取均勻分布計算，其不確定度為因此由體積100 mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定中，移液器引入的不確定度

采用差量法使用1 000 μL 移液器分別移取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照J(rèn)JG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》，1 000 μL 移液器的最大允差為±1.0% mL，取均勻分布計算，1 000 μL 移液器引入的不確定度為；20℃時水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，在實驗室中環(huán)境溫度變動為±5℃，取均勻分布計算，其不確定度為故1 000 μL 移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度合成

合成以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和溶液配制過程中可能影響竹蓀多糖含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，如下式所示：

2.2.2 樣品處理引入的不確定度

2.2.2.1 樣品稱量引入的不確定度

由檢定證書得到FA2004 電子天平的最大允差為±0.1 mg，取均勻分布計算，則電子天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為；其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2.2 樣品測定中，容量瓶引入的不確定度

實驗使用的容量瓶體積為100 mL（A等品），依據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃容器檢定規(guī)程》中查得允差為±0.1 mL，取均勻分布計算，則該容量瓶引入的不確定度為；20℃時水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，在實驗室中環(huán)境溫度變動為±5℃，取均勻分布計算，其不確定度為故100 mL 容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2.3 樣品測定中，移液器引入的不確定度

2.2.2.4 樣品測定中，比色管體積引入的不確定度

2.2.2.5 樣品不確定度合成

綜上所述，樣品處理引入的不確定度合成如下式：

2.2.3 紫外可見分光光度計引入的不確定度

2.2.3.1 苯酚-硫酸法使用紫外可見分光光度計引入的不確定度

由5100 系列紫外可見分光光度計用戶手冊可知，該儀器的光度準(zhǔn)確度為±0.5%，取均勻分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度平均值A(chǔ)0為0.290，竹蓀提取液吸光度平均值A(chǔ)X為0.196，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.2.3.2 蒽酮-硫酸法使用紫外可見分光光度計引入的不確定度

由5100 系列紫外可見分光光度計用戶手冊可知，該儀器的光度準(zhǔn)確度為±0.5%，取均勻分布計算，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度平均值A(chǔ)01為0.326，竹蓀提取液吸光度平均值A(chǔ)X1為0.210，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

2.2.4.1 苯酚-硫酸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

配制7 種不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)苯酚-硫酸法操作，每種濃度分別在紫外可見分光光度計上測定，其濃度與吸光度值的關(guān)系如表1 所示，根據(jù)測量數(shù)據(jù)用最小二乘法擬合，得出回歸方程A1=aCi+b，斜率a=0.038 79，截距b=-0.001，R2=0.9994，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得吸光度的理論值aCi+b，計算Ai和的差值，根據(jù)貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

根據(jù)表1 計算可得，式中S為殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；p=7（竹蓀提取液的測定次數(shù)）；n=7（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)）；Ai為第i次測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得理論吸光度值；CX為竹蓀提取液的平均濃度（CX=5.10 μg/mL）；Ci為第i次測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度.

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算結(jié)果表Table 1 Calculation results of glucose standard solution potency and absorbance value in standard curve

2.2.4.2 蒽酮-硫酸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

配制7 種不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，依據(jù)蒽酮-硫酸法操作，每種濃度分別在紫外可見分光光度計上測定，其濃度與吸光度值的關(guān)系如表2 所示.根據(jù)測量數(shù)據(jù)用最小二乘法擬合，得出回歸方程A2=aCj+b，斜率a=0.047 71，截距b=0.001，R2=0.9992，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得吸光度的理論值aCj+b，計算Aj和的差值，根據(jù)貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算結(jié)果表Table 2 Calculation results of glucose standard solution potency and absorbance value in standard curve

式中S0為殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；p=7（竹蓀提取液的測定次數(shù)）；n=7（葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)）；Aj為第j次測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得理論吸光度值；CY為竹蓀提取液的平均濃度（CY=4.38 μg/mL）；Cj為第j次測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度.

2.2.5 樣品重復(fù)性引入的不確定度

2.2.5.1 苯酚-硫酸法的樣品重復(fù)性引入的不確定度

竹蓀多糖含量的重復(fù)性測量結(jié)果見表3，由貝塞爾公式求得標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）：

表3 兩種方法測定竹蓀多糖含量重復(fù)性測量結(jié)果表Table 3 Repeatability measurement results of Dictyophora Indusiata’s Polysaccharide by two methods

2.2.5.2 蒽酮-硫酸法的樣品重復(fù)性引入的不確定度

竹蓀多糖含量的重復(fù)性測量結(jié)果見表3，由貝塞爾公式求得標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=7）：

2.2.6 合成不確定度

2.2.6.1 苯酚-硫酸法合成不確定度

表4 不確定度有關(guān)參量及貢獻(xiàn)率Table 4 Uncertainty-related parameters and contribution rate

2.2.6.2 蒽酮-硫酸法合成不確定度

表5 不確定度有關(guān)參量及貢獻(xiàn)率Table 5 Uncertainty-related parameters and contribution rate

依據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》的規(guī)定，取包含因子k=2，相對擴(kuò)展不確定度為，所以，竹蓀多糖含量可表示為（58.35±4.10）%.

綜上所述，通過苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定竹蓀多糖含量的不確定度評定，可以得出紫外可見分光光度計和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對測量結(jié)果的不確定度影響較大，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制過程、樣品處理和樣品重復(fù)性測定次之.

3 結(jié)論與結(jié)論

我們以竹蓀多糖提取物為研究對象，采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法兩種方法，利用紫外可見分光光度計測定竹蓀多糖的含量，通過兩種方法對竹蓀多糖含量的不確定度評定，根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》對各因素的不確定度進(jìn)行計算和合成，得出：苯酚-硫酸法測定竹蓀多糖的測定結(jié)果為（67.99±3.72）%，擴(kuò)展不確定度為3.72%（k=2）；蒽酮-硫酸法測定竹蓀多糖的測定結(jié)果為（58.35±4.10）%，擴(kuò)展不確定度為4.10%（k=2），根據(jù)計算所得各個分量的不確定度可知紫外可見分光光度計和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度影響較大，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制過程、樣品處理和樣品重復(fù)性次之.結(jié)果表明蒽酮-硫酸法測得的擴(kuò)展不確定度大于苯酚-硫酸法的擴(kuò)展不確定度，因此苯酚-硫酸法是測定竹蓀多糖較為理想的方法.

實驗過程中我們要嚴(yán)格按照實驗操作的要求，控制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及擬合，并選用靈敏度高的紫外可見分光光度計，嚴(yán)格其進(jìn)行校準(zhǔn)和檢定，以減少其引入的不確定度，可提高檢測質(zhì)量和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.本研究為確定合理的竹蓀多糖含量測定方法和評定測定結(jié)果的質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，并為竹蓀及其產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支持.