極危植物九龍山榧的大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育研究

冉鈺岑，何 芳，劉菊蓮，鄭子洪，鄭偉成，胡江琴，金孝鋒

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省森林芳香植物康養(yǎng)功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2. 杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121；3. 浙江九龍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 管理中心，浙江 遂昌 323300）

九龍山榧Torreya jiulongshanensis為紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya高大喬木，雌雄異株，僅分布于浙江中部和西南部，模式產(chǎn)地為遂昌九龍山，被列為浙江省極小種群保護(hù)植物，最近一次被評(píng)估為極危(CR)植物[1]。2021年頒布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》中，其被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物(http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2021-09/09/content_5636409.htm)。目前，九龍山榧的種群數(shù)量極少，僅17株，其中模式產(chǎn)地僅1雌2雄共3株，每年結(jié)籽量很少，無(wú)幼樹和幼苗，更新困難，而且生境破壞嚴(yán)重，人為干擾程度大[2-4]。九龍山榧作為榧屬的古老孑遺植物，對(duì)研究古植物學(xué)和古地理學(xué)具有重要意義，其對(duì)于改良香榧T. grandis‘Merrillii’品質(zhì)也可能具有很大的潛在價(jià)值[5]。

植物的有性生殖發(fā)育異常是瀕危的主要原因之一，珍稀瀕危植物或多或少存在生殖障礙[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)：云南紅豆杉Taxus yunnanensis不僅生殖周期長(zhǎng)，且在1個(gè)雌配子體上有多個(gè)頸卵器，但最終只有1個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)頸卵器能得到精子，傳粉效率低及雌雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育不同步是造成其瀕危的主要原因[8]；香果樹Emmenopterys henryi在胚發(fā)育過(guò)程中存在明顯胚后熟現(xiàn)象，致使種子萌發(fā)率低，更新困難[9]；羊角槭Acer yangjuechi在雌配子體發(fā)育過(guò)程中存在嚴(yán)重的生殖障礙，出現(xiàn)胚珠敗育、胚囊退化及珠心組織細(xì)胞死亡等現(xiàn)象，是其瀕危的重要原因[10]；崖柏Thuja sutchuenensis從大、小孢子葉球形成至種子成熟的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均存在敗育，而胚珠敗育及雌配子體游離核時(shí)期至幼胚發(fā)育期間的敗育是其生殖障礙的主要原因[11]。

自20世紀(jì)初以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)榧屬幾種植物生殖生物學(xué)開展了研究[12-14]。然而，關(guān)于九龍山榧生殖生物學(xué)的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用石蠟切片法，對(duì)九龍山榧大、小孢子的發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行研究，并與紅豆杉科其他植物加以比較，旨在從生殖生物學(xué)角度探討九龍山榧的種子發(fā)育及結(jié)籽率低下是否與其大、小孢子的發(fā)生和雌、雄配子的發(fā)育異常有關(guān)，以期為九龍山榧保育措施的制定提供生殖生物學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

九龍山榧取自模式產(chǎn)地：麗水市遂昌縣王村口鎮(zhèn)西坑下村(28°20′01″N，118°55′22″E，海拔501 m)。以林緣僅有的1雌株和與雌株相近的1雄株為樣株。

1.2 試驗(yàn)方法

2018年6月底至2019年4月初，在小孢子葉球(雄球花)的芽分化到散粉期間，對(duì)其外部形態(tài)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀測(cè)、拍照，并記錄發(fā)育的各個(gè)時(shí)間段和重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。2018年6月28日至2019年2月13日，隔3 d采1次；2019年2月中旬至2019年4月初散粉，每天采樣。每次取樣5個(gè)。

2018年11月12日至2019年11月30日，在大孢子葉球(雌球花)的芽分化到種子發(fā)育期間，對(duì)其外部形態(tài)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀測(cè)、拍照，記錄各個(gè)發(fā)育時(shí)間段和重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)。2018年11月12日至2019年4月4日，隔6 d采1次；2019年4月5—30日，每天取樣。每次取樣5個(gè)。

2019年4月5—6日的散粉期間，用毛筆對(duì)吐露傳粉滴的胚珠進(jìn)行人工授粉，授粉2 h后進(jìn)行觀察，對(duì)仍有傳粉滴吐露的胚珠進(jìn)行補(bǔ)粉，直到該大孢子葉球不再吐露傳粉滴。2019年5月1日至2019年11月30日，隔6 d對(duì)大孢子葉球進(jìn)行采樣。每次采集3～5個(gè)。

采集的大、小孢子葉球浸泡固定于FAA溶液(體積分?jǐn)?shù)為38%甲醛溶液∶冰醋酸∶體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液=1∶1∶18，體積比)中，置于4 ℃冰箱中冷藏保存。采用常規(guī)石蠟切片法進(jìn)行制片，切片厚度為5～7 μm[15]，用改良愛(ài)氏蘇木精染色[16]，中性樹膠封片，在Motic BA410E顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大小孢子葉球的生長(zhǎng)發(fā)育

2.1.1 小孢子葉球的生長(zhǎng)發(fā)育 2018年6月29日，九龍山榧雄株的多數(shù)枝條葉腋處已經(jīng)可見(jiàn)新生的混合芽，長(zhǎng)為2.78～3.96 mm[(2.40±0.11) mm]，寬為1.18～1.58 mm[(1.38±0.14) mm]，混合芽著生于當(dāng)年生枝條上，偶見(jiàn)于2年生枝條(圖1A)。2018年9月22日，幼嫩的小孢子葉球體積明顯變大，長(zhǎng)為2.24～2.55 mm[(2.40±0.11) mm]，寬為1.18～1.58 mm[(1.36±0.16) mm]，外裹鱗片葉，深綠色，頂端扁而寬；營(yíng)養(yǎng)芽的體積變化不大，頂端與莖端相似，保持較尖的圓錐形(圖1B)。此時(shí)，從外觀上很容易將小孢子葉球與營(yíng)養(yǎng)芽區(qū)分出來(lái)。2018年10月12日，小孢子葉球呈圓錐形(圖1C)，外裹綠色鱗片葉，基部著生4枚苞片，2輪鱗片。小孢子葉球單生，長(zhǎng)為2.78～3.96 mm[(3.37±0.47) mm]，寬為1.01～1.91 mm[(1.62±0.38) mm]，有一短軸，軸上螺旋狀緊密排列著30～40枚小孢子葉，小孢子葉背面常著生4個(gè)(稀為3或5個(gè))小孢子囊。2019年2月26日，小孢子葉球中下部變圓，呈淺綠色，芽鱗逐漸張開，露出小孢子囊(圖1D)。2019年3月25日，小孢子葉球葉軸伸長(zhǎng)，小孢子囊突破苞片、鱗片，逐漸伸到芽鱗外(圖1E)，緊密的小孢子葉變得松散，小孢子囊完全暴露在空氣中，開裂后花粉散出，此時(shí)小孢子葉球成熟(圖1F)。成熟的小孢子葉球呈長(zhǎng)圓柱形，飽滿，小孢子葉逐漸變成黃綠色。

2019年4月4日，小孢子囊開始散粉，散粉時(shí)間持續(xù)4 d，時(shí)間較快。散粉前小孢子囊開裂，花粉散出，顏色呈黃色。同一小孢子葉球中，葉軸基部的小孢子囊散粉通常比葉軸上部的早開裂(圖1G)。散粉后，小孢子葉球迅速干縮(圖1H)。

2.1.2 大孢子葉球的生長(zhǎng)發(fā)育 2018年11月12日，1年生枝條頂端存在普通芽和生殖芽，外觀難以區(qū)分(圖1I)。此時(shí)，生殖芽?jī)?nèi)部的苞葉葉腋出現(xiàn)珠被原基的隆起(圖2A)。此后珠被不斷生長(zhǎng)，2019年3月25日，珠被生長(zhǎng)至珠心上方，包被珠心(圖2B)。此時(shí)，大孢子葉球2個(gè)，成對(duì)生于葉腋，外觀呈圓錐形，長(zhǎng)為0.38～0.49 mm[(0.47±0.12) mm]，寬為0.26～0.29 mm[(0.28±0.09) mm]，兩側(cè)微微隆起，外裹綠色鱗片狀葉，著生于1年生雌株枝條頂端。每一大孢子葉球的短軸上緊密排列著4枚兩兩交互對(duì)生的苞片和最基部1枚側(cè)生的苞片，具1個(gè)直立胚珠。2019年3月28日，在小孢子葉球即將散粉前，大孢子葉球逐漸從外包苞片和鱗片中突破，伸到芽鱗外，胚珠開始暴露在空氣中，為接收花粉做準(zhǔn)備(圖1J)。2019年4月6日，假種皮開始露出(圖2C)。此時(shí)，大孢子葉球呈圓球形，長(zhǎng)為1.48～2.12 mm[(1.86±0.24) mm]，寬為1.07～1.47 mm[(1.37±0.28) mm]。2019年4月4—7日為散粉期，胚珠的珠孔端吐露出傳粉滴，授粉后傳粉滴消失(圖1K)。2019年4月23日，假種皮的長(zhǎng)度逐漸生長(zhǎng)至珠被1/2處，可見(jiàn)明顯的珠孔和珠心上部的溶解腔(圖2D)。2019年4月30日，胚珠個(gè)體逐漸變大，外層的珠被和假種皮逐漸伸長(zhǎng)，但還未完全包裹住胚珠的珠孔(圖1L)。2019年6月8—29日，成對(duì)的大孢子葉球僅1個(gè)發(fā)育，發(fā)育的假種皮長(zhǎng)度逐漸超過(guò)珠被，突破鱗片，包裹住胚珠(圖1M和圖1N)，先端較尖。2019年8月29日，胚珠長(zhǎng)度增大，深綠色，胚珠著生的枝條頂端出現(xiàn)新生的小孢子葉球(圖1O)。2019年9月22日，大孢子葉球呈卵球形，長(zhǎng)為6.18～7.28 mm[(6.85±0.42) mm]，寬為3.15～3.50 mm[(3.32±0.11) mm]，胚珠底部變黃，假種皮先端變紅(圖1P)。

圖 1 大、小孢子葉球(雌、雄球花)的發(fā)育Figure 1 Development of microstrobilus and macrostrobilus (male and female strobili)

2.2 小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

2018年8月20日，小孢子葉原基表皮下方的孢原細(xì)胞已經(jīng)分化形成次生造孢細(xì)胞。次生造孢細(xì)胞緊密相連，呈多邊形(圖3A)。2018年11月12日，外層的次生壁細(xì)胞開始分裂、分化，小孢子囊由外而內(nèi)最終形成矩形的表皮層，呈橢圓形的小孢子囊內(nèi)壁，呈不規(guī)則散狀排列的2層中層細(xì)胞，以及最內(nèi)呈長(zhǎng)條形的絨氈層(圖3B)。小孢子囊發(fā)育類型為基本型。2018年11月15日，造孢細(xì)胞分化形成小孢子母細(xì)胞，最初的小孢子母細(xì)胞由于體積較大、排列緊密，呈多邊形，胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核大(圖3C)。2019年1月3日，在小孢子母細(xì)胞不斷形成時(shí)期，最外層的表皮細(xì)胞經(jīng)垂周分裂后，垂周壁加厚，徑向壁延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)液泡化，細(xì)胞核和核仁逐漸消失，木質(zhì)化加強(qiáng)，以適應(yīng)內(nèi)部小孢子母細(xì)胞數(shù)目的增加；內(nèi)壁細(xì)胞徑向延長(zhǎng)，并纖維化加厚；中層細(xì)胞被擠壓，切向壁延長(zhǎng)呈扁平狀緊貼內(nèi)壁；絨氈層細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞時(shí)期最初呈長(zhǎng)條形單核延長(zhǎng)，發(fā)育后期細(xì)胞個(gè)體逐漸變大，細(xì)胞質(zhì)變濃，并以單核或雙核形式存在(圖3D)。2019年2月2日，排列緊密的小孢子母細(xì)胞逐漸從胼胝質(zhì)中解離，變成游離的小孢子母細(xì)胞，形狀從多邊形變?yōu)閳A形(圖3E)。

2019年2月26日至3月6日為小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期。小孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)第1次減數(shù)分裂，形成2個(gè)子核(圖3F)，2個(gè)子核之間不形成細(xì)胞壁直接進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅱ期，再次分裂之后形成四面體形、左右對(duì)稱形2種類型的四分體(圖3G)。小孢子囊壁和中層細(xì)胞開始解體，絨氈層細(xì)胞多為雙核，由絨氈層出現(xiàn)的位置判斷絨氈層細(xì)胞為周原質(zhì)團(tuán)細(xì)胞，絨氈層類型為變形絨氈層。小孢子囊內(nèi)約7%絨氈層出現(xiàn)異常膨大，堆疊在一起(圖3H)。2019年3月12日，四分體中的4個(gè)小孢子之間開始形成各自的細(xì)胞壁(圖3I)。2019年3月16日，四分體開始解體，胼胝質(zhì)壁消失，小孢子的細(xì)胞壁逐漸加厚，形成游離小孢子細(xì)胞(圖3J)，絨氈層部分細(xì)胞進(jìn)入藥室內(nèi)部(圖3K)。2019年3月19日為小孢子細(xì)胞單核靠邊期，表皮細(xì)胞木質(zhì)化加強(qiáng)，內(nèi)壁繼續(xù)解體，中層細(xì)胞僅留下殘跡，絨氈層仍以雙核或單核形式存在(圖3L)。一些小孢子囊內(nèi)游離小孢子內(nèi)液泡化導(dǎo)致細(xì)胞變形，約占11%(圖3M)。

2019年3月31日，單核靠邊的小孢子細(xì)胞壁開始逐漸增厚，細(xì)胞核經(jīng)過(guò)有絲分裂形成2個(gè)核，細(xì)胞質(zhì)也在2個(gè)核之間形成細(xì)胞板將2個(gè)核隔開，其中大的核為管核，小的核為生殖核。此時(shí)，成熟花粉粒形成(圖3N)。成熟花粉粒的直徑為30 μm，雙核，表面褶皺成不規(guī)則狀，無(wú)氣囊?；ǚ鄢墒炱跁r(shí)，小孢子囊內(nèi)壁與中層細(xì)胞僅剩殘跡，絨氈層消失，表皮細(xì)胞完全木質(zhì)化并且?guī)罴雍?圖3O)。2019年4月4—7日，開始散粉時(shí)，小孢子囊囊基部囊壁沒(méi)有加厚的開裂口破裂，從開裂口散出(圖3P)。2019年5月30日，在胚珠上方花粉粒萌發(fā)成花粉管，伸入珠心組織1/3處，花粉管中可清晰看到管細(xì)胞、生殖細(xì)胞和不育細(xì)胞，生殖細(xì)胞比不育細(xì)胞稍大(圖3Q)。2019年6月24日，花粉管入侵至珠心1/2處，生殖核明顯增大，管核與不育核明顯變小，且即將消失(圖3R)。2019年7月27日，花粉管抵達(dá)雌配子體壁，此時(shí)管核和不育核已消失，位于花粉管先端的精原細(xì)胞已分裂成2個(gè)形狀相似、大小相同的精細(xì)胞。精細(xì)胞核大、細(xì)胞質(zhì)濃，形狀為橢圓形或圓形(圖3S)。2019年11月29日，花粉管伸長(zhǎng)至頸卵器上方，精細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞質(zhì)濃厚(圖3T)。九龍山榧小孢子及雄配子體發(fā)育進(jìn)程見(jiàn)表1。

圖 2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育(含受精作用)Figure 2 Megasporogenesis and female gametophyte development (including fertilization)

2.3 大孢子發(fā)生與雌配子體發(fā)育

2019年4月6日，在散粉期，珠心下方與珠被齊平的水平線上出現(xiàn)一團(tuán)核大、質(zhì)濃、呈多邊形的造孢細(xì)胞(圖2E)。①大孢子發(fā)生時(shí)期：2019年4月23日，造孢細(xì)胞分化，在近中央位置形成大孢子母細(xì)胞，并進(jìn)行減數(shù)分裂Ⅰ，形成大孢子二分體，二分體再進(jìn)行減數(shù)分裂Ⅱ(圖2F)，最終形成縱向直列的4個(gè)大孢子。2019年5月18日，合點(diǎn)端的大孢子不斷發(fā)育，最終形成功能性大孢子，近珠孔的3個(gè)大孢子逐漸退化(圖2G)。②游離核時(shí)期：2019年6月6日，合點(diǎn)端的功能大孢子繼續(xù)進(jìn)行多次有絲分裂，形成多核的雌配子體，但不形成細(xì)胞壁，細(xì)胞核呈游離狀態(tài)，分布在雌配子體的細(xì)胞質(zhì)中(圖2H)。游離核之間由染色質(zhì)絲相連。③細(xì)胞化時(shí)期：2019年8月11日，當(dāng)游離核分裂8次，形成256個(gè)游離核后，在連接游離核間原生質(zhì)絲的基礎(chǔ)上，開始向心式形成細(xì)胞壁，最后整個(gè)雌配子體完全細(xì)胞化(圖2I)。④頸卵器時(shí)期：當(dāng)雌配子體不斷發(fā)育到一定程度，近珠孔端的一些細(xì)胞開始逐漸膨大，形成頸卵器母細(xì)胞。2019年9月22日，頸卵器母細(xì)胞進(jìn)行平周和垂周分裂，最終形成4個(gè)較小的頸細(xì)胞和1個(gè)較大的中央細(xì)胞(圖2J)。剛形成的頸細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核明顯，個(gè)體較周圍細(xì)胞小，中央細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核較大，周圍細(xì)胞質(zhì)濃。中央細(xì)胞進(jìn)行1次不均等分裂，形成卵核和腹溝核，腹溝核很快消失。由于此過(guò)程發(fā)生較快，因此未捕捉到正在退化的腹溝核。2019年9月30日，初形成的卵核位于頸卵器的近珠孔端，周圍有少量細(xì)胞質(zhì)包圍，卵核下方有1個(gè)大液泡(圖2K)。2019年10月13日，卵核開始下沉，往頸卵器的中央開始移動(dòng)，同時(shí)蛋白泡出現(xiàn)(圖2L)。2019年11月12日，受精前，成熟的頸卵器中蛋白泡消失，細(xì)胞質(zhì)變濃，卵細(xì)胞發(fā)育成熟且位于中央，等待受精(圖2M)。九龍山榧的頸卵器為橢圓形，多數(shù)位于雌配子體的近珠孔端，同一胚珠中有2個(gè)頸卵器。頸卵器的周圍通常緊密排列著1層套細(xì)胞，套細(xì)胞的細(xì)胞核大、體積較小(圖2L～M)。本研究觀察到九龍山榧每個(gè)胚珠中只產(chǎn)生1個(gè)雌配子體，含2個(gè)單生型頸卵器，與香榧相同。九龍山榧的大孢子及雌配子體發(fā)育進(jìn)程見(jiàn)表1。

圖 3 小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育(含精子形成)Figure 3 Microsporogenesis and male gametophyte development (including spermatogenesis)

表 1 九龍山榧的有性生殖過(guò)程Table 1 Process of sexual reproduction in T. jiulongshanensis

2.4 精卵受精

九龍山榧的受精作用發(fā)生于2019年11月29日，從傳粉到受精約7個(gè)月，在花粉管中產(chǎn)生2個(gè)大小相似的精細(xì)胞(圖3T)，受精前其中一個(gè)精細(xì)胞進(jìn)入頸卵器中與卵細(xì)胞結(jié)合，另一個(gè)則停留在花粉管中(圖2N)。在精細(xì)胞接觸卵細(xì)胞前，精細(xì)胞邊緣整齊，細(xì)胞核明顯，兩者接觸時(shí)，精細(xì)胞邊緣開始變得模糊，細(xì)胞質(zhì)因變得蓬松而染色較淺(圖2O)。在精細(xì)胞和卵細(xì)胞逐漸融合的過(guò)程中，精細(xì)胞核區(qū)逐漸消失，細(xì)胞質(zhì)相融(圖2P)。

3 討論

裸子植物小孢子母細(xì)胞發(fā)育節(jié)律主要分為4種類型[17-20]：①小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程起始于初冬，進(jìn)入休眠期停止減數(shù)分裂，在翌年春季解除休眠后完成后續(xù)發(fā)育，如側(cè)柏Platycladus orientalis。②翌年春天形成造孢細(xì)胞，再分化成小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞不經(jīng)過(guò)休眠直接開始進(jìn)行減數(shù)分裂，如穗花杉Amentotaxus argotaenia。③小孢子母細(xì)胞于當(dāng)年年底前已經(jīng)分化形成，經(jīng)過(guò)翌年春季才開始后續(xù)的減數(shù)分裂過(guò)程，如歐洲赤松Pinus sylvestris。④小孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂并形成游離小孢子再越冬，翌年春季繼續(xù)發(fā)育為成熟花粉，紅豆杉屬Taxus加拿大紅豆杉T. canadenesis、短葉紅豆杉T.brevifolia、南方紅豆杉T. wallichianavar.mairei和云南紅豆杉T. yunnanensis等屬此類型。九龍山榧與香榧小孢子母細(xì)胞的發(fā)育方式相同[21]，這種發(fā)育方式避免了其減數(shù)分裂過(guò)程受到寒冷冬季低溫影響，降低了減數(shù)分裂發(fā)生異常的風(fēng)險(xiǎn)。九龍山榧在減數(shù)分裂時(shí)期部分小孢子囊的絨氈層發(fā)生異常增生和膨大現(xiàn)象。陳祖鏗等[22]對(duì)穗花杉研究發(fā)現(xiàn)：絨氈層細(xì)胞發(fā)生異常膨大在裸子植物發(fā)育中為異?，F(xiàn)象，其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致小孢子母細(xì)胞受到擠壓，在減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生異常，最終引起花粉敗育。這也曾在太白紅杉Larix chinensis[23]的小孢子發(fā)育過(guò)程中有過(guò)報(bào)道。九龍山榧花粉囊中的絨氈層從小孢子母細(xì)胞時(shí)期一直持續(xù)存在到單核靠邊期，直到形成成熟花粉粒才完全降解。絨氈層的延遲降解可能會(huì)爭(zhēng)奪游離小孢子細(xì)胞發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間。單核靠邊期時(shí)，少部分小孢子囊中出現(xiàn)小孢子細(xì)胞內(nèi)液泡化現(xiàn)象，導(dǎo)致一些細(xì)胞形狀變化、破裂。但由于花粉粒能在雌花胚珠的珠心上方萌發(fā)出花粉管，且雄配子體的發(fā)育基本正常，說(shuō)明花粉粒具備正常的生理活性和后期生殖功能，這與本研究對(duì)其花粉活力測(cè)定的結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，小孢子的發(fā)生和雄配子體的發(fā)育均正常。

裸子植物的花粉萌發(fā)普遍遲緩且花粉管的生長(zhǎng)非常緩慢[24]。穗花杉于5月底開始散粉，7月中下旬形成精子，歷時(shí)約2個(gè)月[25]；短葉紅豆杉于4月底萌發(fā)花粉管，6月初形成精子，歷時(shí)1個(gè)多月[26]；南方紅豆杉2月中下旬散粉，4月中旬體細(xì)胞迅速分裂形成2個(gè)精子，歷時(shí)約2個(gè)月[20]；香榧于4月下旬散粉，7月中下旬花粉管中體細(xì)胞核分裂出2個(gè)大小相等的精核，過(guò)程近3個(gè)月[27]。九龍山榧4月初散粉，4月底花粉才開始萌發(fā)出花粉管，7月底雌配子體上方產(chǎn)生2個(gè)精原細(xì)胞。因此，九龍山榧從傳粉到形成精子，整個(gè)過(guò)程歷時(shí)近4個(gè)月，發(fā)育周期均較紅豆杉科其他種更長(zhǎng)。這可能是雄配子體在花粉管中發(fā)育緩慢以等待頸卵器中的卵細(xì)胞發(fā)育成熟以完成受精[20]。受精延遲現(xiàn)象在裸子植物中普遍存在。白豆杉Pseudotaxus chienii于4月17日傳粉，5月下旬陸續(xù)發(fā)生受精作用，兩者相隔1個(gè)多月[28]；穗花杉于5月25日至6月15日傳粉，7月20—29日受精，兩者相隔約2個(gè)月[22]；云南紅豆杉的受精作用發(fā)生于3月底至4月初，傳粉與受精相隔約4個(gè)月[8]；香榧于4月下旬授粉，9月上旬發(fā)生受精作用，從傳粉到受精間隔4～5個(gè)月[27]。在本研究中，九龍山榧于4月初開始傳粉，11月下旬發(fā)生受精作用，從傳粉到受精需要約7個(gè)月，晚于紅豆杉科已經(jīng)報(bào)道的大多數(shù)植物。

植物有性生殖過(guò)程的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙，都會(huì)造成生殖失敗，種子減少，更新困難從而致瀕[29]。九龍山榧小孢子葉球8月中旬開始發(fā)生，至2019年7月底才形成精子，歷時(shí)11個(gè)月余；大孢子葉球11月中上旬開始發(fā)生，至2019年11月底才進(jìn)行受精作用，過(guò)程歷時(shí)12個(gè)月余，雌雄生殖系統(tǒng)發(fā)育的周期均較紅豆杉科以往報(bào)道的其他種更長(zhǎng)。生殖過(guò)程歷時(shí)久、環(huán)節(jié)多，增加花粉敗育、胚珠死亡的概率[8]，且從傳粉到受精時(shí)間跨度大，加之個(gè)體數(shù)量極少，僅1雌株2雄株，胚珠發(fā)育嚴(yán)重滯后于小孢子葉球的散粉期，可能導(dǎo)致受精率降低甚至受精作用受阻。此外，陳佳妮等[30]發(fā)現(xiàn)：香榧結(jié)籽高于榧樹，在于前者成熟葉片的氮含量和光合能力顯著高于后者。九龍山榧為喜光的陽(yáng)生樹種[31]，其結(jié)籽率低的原因可能還與雌株樹體老化、光合生理特性、外界營(yíng)養(yǎng)不足等有關(guān)。

可見(jiàn)，九龍山榧冗長(zhǎng)的生殖周期、復(fù)雜的生殖過(guò)程和雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育明顯滯后于雄性生殖系統(tǒng)，加之人為干擾強(qiáng)、樹體老化、營(yíng)養(yǎng)不足、個(gè)體數(shù)量少等均可能造成其結(jié)籽率底、自然更新困難，進(jìn)而致瀕。從實(shí)際出發(fā)，對(duì)九龍山榧的保育可以借鑒香榧的培育技術(shù)：①由于九龍山榧雌雄異株，小種群中的花粉密度很難達(dá)到較高的水平，胚珠傳粉滴的吐露容易受不良天氣的影響，因此在散粉期收集足夠的花粉，將花粉合理優(yōu)化保存，分期在晴天進(jìn)行人工授粉以提高授粉率[32]；②加強(qiáng)雌株的科學(xué)管理，平衡施肥，追施磷、鉀復(fù)合肥[33]，淺根多次施肥，繁殖期葉面施淡肥[34]，從而促進(jìn)胚的發(fā)育和提高坐果率。

4 致謝

材料采集過(guò)程中得到浙江遂昌王村口鎮(zhèn)西坑下村嚴(yán)東根先生的無(wú)私幫助。在此深表謝意！