一種黑腹果蠅原種的培養(yǎng)方法

胡 甘，孟 敏，王竹林

（西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100）

黑腹果蠅是遺傳學(xué)研究與教學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)材料之一[1-3]。1908年遺傳學(xué)家摩爾根在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培育并對(duì)它進(jìn)行系統(tǒng)的研究，隨之把它帶入了經(jīng)典遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域中，用它作為材料證實(shí)了孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，此外還發(fā)現(xiàn)了果蠅白眼突變的性連鎖遺傳規(guī)律，提出了基因在染色體上直線排列及連鎖交換的規(guī)律，并被廣泛應(yīng)用。在現(xiàn)代生態(tài)學(xué)、群體生物學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、行為學(xué)、基因組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，果蠅作為遺傳學(xué)模式生物材料也得到了廣泛的應(yīng)用[4]，主要是因?yàn)楣壱云渖钍范?、易于飼養(yǎng)、繁殖量大、染色體數(shù)目少、變異類型多等優(yōu)點(diǎn)成為生命科學(xué)研究中最重要的模式動(dòng)物。如基因編輯技術(shù)、新一代轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)等。

在高等院校遺傳學(xué)教學(xué)過(guò)程中，用果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料的項(xiàng)目有：果蠅實(shí)驗(yàn)技術(shù)、果蠅唾腺染色體觀察、果蠅雜交大實(shí)驗(yàn)室的討論等，占遺傳學(xué)課程開(kāi)設(shè)實(shí)驗(yàn)總項(xiàng)目數(shù)的35%[5]，是農(nóng)科、生物及醫(yī)學(xué)類各專業(yè)本科學(xué)必做的典型實(shí)驗(yàn)。然而，在果蠅培養(yǎng)過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基污染、長(zhǎng)勢(shì)弱、羽化數(shù)量少等問(wèn)題，因此，獲得良好的實(shí)驗(yàn)材料是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，即材料質(zhì)量越高，實(shí)驗(yàn)成功率就越高。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)果蠅材料培養(yǎng)方法做了合理改進(jìn)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

1 果蠅原種培養(yǎng)基組成及基本配制方法

1.1 培養(yǎng)基組成

果蠅首要食物來(lái)源于水果腐爛的微生物及其他發(fā)酵的有機(jī)物，如：酵母菌和細(xì)菌等，其次是以含糖的水果為食物，喜歡營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐實(shí)和溫暖濕潤(rùn)的生存環(huán)境。西北農(nóng)林科技大學(xué)遺傳工程實(shí)驗(yàn)室所需原料成分及數(shù)量如表1所示：

表1 培養(yǎng)基的組成成分

1.2 培養(yǎng)基制備

配制時(shí)，先將水分成兩份，其中一份用于煮溶瓊脂和蔗糖，另一份煮溶玉米粉，待兩份分別溶解煮好后再合到一起煮沸至稠糊狀，期間不斷攪拌，防止糊底，去火后再加酵母粉和丙酸。然后，將粘稠的培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢韬笤俜盅b在50 mL三角培養(yǎng)瓶中，厚度2 cm左右，把滅菌的粗濾紙剪成小方塊折疊成扇面狀（縮短三齡幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間，羽化成蟲(chóng)多），插入培養(yǎng)基中間，加蓋棉塞，在0.11 mp、121 ℃下滅菌15 min[6]，待培養(yǎng)基冷卻后，即可分裝果蠅。冷卻后的培養(yǎng)基也可放入冰箱冷凍層中保存，接種時(shí)取出，置于桌面上自然解凍，隨后分裝果蠅。長(zhǎng)期保存我們選用高壓滅菌然后冷凍的方法，現(xiàn)配現(xiàn)用。25 ℃發(fā)酵2～3 d，分裝果蠅，此方法適用擴(kuò)大原種種群，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)。缺點(diǎn)是易污染和干燥。因此，只能短期使用，最好使用一代，隨即棄之。

2 果蠅原種的培養(yǎng)方法

（1）接種。接種前，將配制好的培養(yǎng)基放在25 ℃培養(yǎng)箱中，待1～2 d后酵母菌大量繁殖，創(chuàng)造果蠅營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的生存環(huán)境，隨后仔細(xì)檢查品種是否出現(xiàn)混雜。用75%酒精噴灑超凈工作臺(tái)，擦拭雙手及操作器械，在無(wú)菌條件下，將12 h以內(nèi)羽化出的果蠅培養(yǎng)瓶與麻醉瓶口對(duì)口相接，麻醉瓶在下培養(yǎng)瓶在上，輕拍瓶壁震落果蠅[7]。此后，從麻醉瓶口滴入2～3滴乙醚，輕輕晃動(dòng)，輕度麻醉。0.5 min后[8]果蠅整體昏迷，迅速倒在白瓷板上，選取個(gè)體較大，性狀具有本品種特征明顯的雌雄果蠅各5只，用毛筆掃入側(cè)倒的新制培養(yǎng)瓶中配對(duì)繁殖，待清醒后，豎立加塞，防止原種粘附在培養(yǎng)基上死亡。每個(gè)品種至少保留兩套[9]，注明名稱和時(shí)期。隨后將剩余果蠅立即投入裝有70%酒精的死蠅瓶中。

（2）培養(yǎng)。原種保存必須在單獨(dú)的環(huán)境中分房、分箱獨(dú)立培養(yǎng)，溫度是控制生長(zhǎng)發(fā)育和培養(yǎng)基使用時(shí)間的唯一手段。將果蠅原種置于25 ℃培養(yǎng)箱中有光培養(yǎng)3～4 d，在適宜溫度下雄蠅不停飛舞，表現(xiàn)活躍。尋求交配，產(chǎn)卵。大量的蟲(chóng)卵產(chǎn)于培養(yǎng)基表面后，溫度調(diào)至18 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，延長(zhǎng)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)周期，使其充分的生長(zhǎng)發(fā)育和吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，達(dá)到育肥的目的[10]。培養(yǎng)溫度不同，培養(yǎng)基消耗程度就不同，后期的營(yíng)養(yǎng)成分殆盡。應(yīng)減少轉(zhuǎn)接次數(shù)，防止品種混雜的概率。一般4周左右更換培養(yǎng)基，這樣才能保證原種長(zhǎng)期性、連續(xù)性地健康生長(zhǎng)。果蠅生長(zhǎng)規(guī)律詳見(jiàn)表2。

表2 25 ℃果蠅發(fā)育過(guò)程及現(xiàn)象

果蠅在不同溫度下生長(zhǎng)速度是不同的，高溫生長(zhǎng)快，消耗的食物也多，果蠅在不同溫度下消耗培養(yǎng)基時(shí)間大致規(guī)律如圖1所示。

圖1 果蠅在不同溫度下消耗培養(yǎng)基時(shí)間

3 常見(jiàn)問(wèn)題處理

3.1 培養(yǎng)基發(fā)霉

原種在保存過(guò)程中，由于長(zhǎng)期在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，通風(fēng)不良，時(shí)間久易滋生霉菌。霉菌生長(zhǎng)快，活性強(qiáng)，不易剔除，并迅速蔓延。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基小面積污染，可用酒精火焰滅菌過(guò)的接種環(huán)將霉菌斑挑出，剔除的范圍相對(duì)大一些。操作時(shí)注意動(dòng)作輕緩，避免霉菌孢子漂浮于培養(yǎng)瓶的整個(gè)空間[11]，然后觀察48 h，確認(rèn)除去污染即可。若染上霉菌，將帶有霉菌孢子成蠅倒入滅菌過(guò)的空培養(yǎng)瓶中，棉塞上滴適量75%酒精，利用其揮發(fā)性，使其充滿整個(gè)瓶?jī)?nèi)，時(shí)間2 h為宜，第二天再次把果蠅轉(zhuǎn)另一新培養(yǎng)瓶中，反復(fù)5～6次，過(guò)程同樣。然后倒入裝有培養(yǎng)基瓶中，觀察48 h。如果是培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)大面積污染，此原種必須停止使用，立即淘汰。

3.2 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁出現(xiàn)水珠

培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶時(shí)熱蒸汽會(huì)凝結(jié)在瓶壁，冷卻后，產(chǎn)生水珠。使用前若發(fā)現(xiàn)瓶壁沾有水珠，則需要用滅菌濾紙條吸干或用滅菌干棉球擦干，以免移入的果蠅被粘住溺死。

3.3 培養(yǎng)基干結(jié)

配制的培養(yǎng)基放置時(shí)間過(guò)久或培養(yǎng)溫度較高時(shí)，培養(yǎng)基因?yàn)槭c瓶壁分離，干結(jié)成塊，影響果蠅正常生存，無(wú)法產(chǎn)卵，出現(xiàn)壽命短、長(zhǎng)勢(shì)弱、無(wú)后代的情況?？捎脺缇^(guò)的蒸餾水，使用移液器適量加入培養(yǎng)基與瓶壁分離處[12]，達(dá)到其生長(zhǎng)環(huán)境60%的濕度。

3.4 培養(yǎng)基過(guò)稀

如果在培養(yǎng)基制備過(guò)程中沒(méi)有掌握好原料煮沸的稀稠，灌裝滅菌后，培養(yǎng)基冷卻，干結(jié)程度不夠?？刹捎脤⑴囵B(yǎng)瓶放入30 ℃培養(yǎng)箱中，脫水2～3 d，時(shí)間自行掌握。達(dá)到一定的干濕度，接入原種。培養(yǎng)的過(guò)程中出現(xiàn)培養(yǎng)基滲出多余的水分，可用滅菌干棉球貼壓表面，吸走多余水分。避免果蠅粘附在培養(yǎng)基表面，無(wú)法飛行和覓食而死亡。

3.5 原種復(fù)壯

由于果蠅長(zhǎng)期在無(wú)通風(fēng)且相對(duì)偏低的溫度下保存，使其活力下降，性狀出現(xiàn)退化，表現(xiàn)在體色減弱，性功能衰退，幼蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生寄生蟲(chóng)（將幼蟲(chóng)身體解剖，平拉開(kāi)，鏡檢），影響身體健康。因此，每次接移原種，都要采取剛羽化的成蟲(chóng)作為原種來(lái)保存。

3.6 品種死亡丟失

在培養(yǎng)保存原種的長(zhǎng)期過(guò)程中，由于環(huán)境和人為多方面因素，造成果蠅死亡，品種丟失，可采取雜交選純的方法來(lái)恢復(fù)本品種。前提條件是必須存在一定的性狀資源。通過(guò)選取所需性狀雜交，對(duì)其后代F1相同性狀的處女蠅不斷篩選、繁殖，直至完全純合，獲取你需要的品種資源。否則需引種。這一方法也適用果蠅新品系開(kāi)發(fā)，擴(kuò)大種質(zhì)資源庫(kù)，為教學(xué)和科研提供豐富的材料來(lái)源。

4 小結(jié)

用以上方法培養(yǎng)的果蠅具有明顯的優(yōu)勢(shì)，提升了原種活力，保持了原種純度，遺傳了本品系性狀特征；蟲(chóng)卵產(chǎn)量多，長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良，幼蟲(chóng)肥大；羽化成蟲(chóng)群體大，身體強(qiáng)壯，生命力旺盛；為遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供豐富的基礎(chǔ)性材料等，值得同行借鑒。