超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法測定液態(tài)奶中的氟他胺和羥基氟他胺

氟他胺（Flutamide）是一類用于治療前列腺癌的抗雄性激素藥物，在臨床上有廣泛的應(yīng)用[1-3]，其作用機理主要為阻斷雄性激素對前列腺的作用，從而對前列腺腫瘤進行抑制[4]。同時也有研究表明，氟他胺能有效抑制高雄激素血癥[5]，能提高多囊卵巢綜合癥患者的糖代謝能力和脂代謝能力[6]，改善患者的排卵情況[7]。由于其作用為抑制雄性激素，效果與雌激素相似，在乳制品行業(yè)中經(jīng)常被不法商家用于奶牛飼養(yǎng)[8-9]，以達到促進機體成長和促乳的效果[10-11]。我國目前還沒有相關(guān)的法律法規(guī)規(guī)定氟他胺在乳制品中的限量，也沒有相關(guān)的國標(biāo)測定方法。

目前，抗激素類藥物的檢測方法主要有分光光度法[12]、液相色譜法[13-15]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-20]。分光光度法需要對目標(biāo)物進行衍生，且難以同時測定代謝物，分析結(jié)果受雜質(zhì)影響大。液相色譜法分離難度大，檢測器靈敏度較低，適用于藥片或含量較大的樣品測定，對于含量較低的樣品難以檢出，且難以準(zhǔn)確定量。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法則具選擇性強、分析時間短、定性能力高的優(yōu)點。本文建立了高分辨飛行時間質(zhì)譜法測定液態(tài)乳中的氟他胺及羥基氟他胺，該方法高效、回收率好、結(jié)果偏差小，對乳制品中抗激素藥物殘留相關(guān)檢測方法的研究有較大的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟他胺和羥基氟他胺（＞99.0%，上海安譜公司）；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚（HPLC級，美國賽默飛公司）；C18、PSA、GCB、硅膠、NH2粉、中性氧化鋁、無水Mg2SO4、NaCl（分析純，上海安譜公司）；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

API5600+質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；LC-20AD液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（法國Merck Millipore公司）；4k-15離心機（德國Sigma公司）；KQ-800DB超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；Multi Reax渦旋振蕩器（德國Heidolph公司）；Promax 2020搖床（德國Heidolph公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取氟他胺和羥基氟他胺標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，乙腈稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的溶液，于-4 ℃保存。

基質(zhì)曲線：選取陰性樣品按照1.3.2的方法處理，得到空白基質(zhì)液，稀釋后得到基質(zhì)曲線，各級濃度為1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1和100 μg·L-1。

1.3.2 前處理方法

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 水，渦旋振搖5～10 s，然后加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，振搖15 min。以10 000 r·min-1離 心5 min，準(zhǔn) 確 移 取1 mL上 清液，40 ℃氮吹至干，加入1 mL乙腈復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至1.5 mL含有100 mg C18粉末的離心管中，渦旋2 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜上機。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進樣量為5.0 μL；柱溫為35 ℃；流動相：流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脫模式：等度洗脫，A∶B=80∶20。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：ESI和APCI復(fù)合源，負(fù)離子掃描；一級TOF-MS掃描質(zhì)量范圍（m/z）：50～500 Da；二級IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍（m/z）：50～500 Da；每10個樣品自動校正1次，負(fù)離子模式校正液流速為0.5 mL·min-1；氣簾氣（N2）：35 psi；離子源霧化氣（N2）：45 psi；離子源加熱輔助氣（N2）：45 psi；離子源溫度為450 ℃；離子源電壓-4 500 V。去簇電壓DP為90 V，碰撞能量CE為（30±15）eV；監(jiān)測模式：TOF-IDA-MS。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析處理

化合物的碎片信息使用Analyst TF 1.6軟件采集，并采用PeakView 2.0、MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件進行進一步的處理，獲得一級離子和二級碎片離子的質(zhì)荷比、精確分子質(zhì)量及其同位素比值等。氟他胺和羥基氟他胺的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟他胺和羥基氟他胺的碎片參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

實驗前期分別使用乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚3種有機溶劑進行實驗，考查對應(yīng)的回收率。結(jié)果顯示，乙腈作為有機溶劑時，對氟他胺和羥基氟他胺的回收率最低，乙酸乙酯和叔丁基甲醚的極性與目標(biāo)物更為接近，因此回收率較高。此外，雖然叔丁基甲醚沸點要比乙酸乙酯低，更有利于氮氣濃縮，但乙酸乙酯的回收率要略高于叔丁基甲醚。因此綜合考慮，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。結(jié)果詳見圖1。

圖1 不同提取劑對回收率的影響圖

2.2 提取方式的選擇

實驗對比了搖床、超聲和渦旋振蕩3種提取方式。前期對比了提取5 min、10 min、15 min、20 min和25 min時回收率的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種提取方式在同樣提取時間(15 min）下，回收率基本能達到最優(yōu)值，提取時間為15 min、20 min、25 min時，實驗結(jié)果差別不大，因此為節(jié)省實驗時間，選擇提取時間為15 min。其中，渦旋振蕩和搖床的提取方式要較超聲提取更優(yōu)，回收率均在90%以上。超聲回收率只有70%～80%。實驗結(jié)果顯示，渦旋振蕩和搖床回收率相當(dāng)，最終選擇搖床作為提取方式，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取方式對回收率的影響圖

2.3 分散固相萃取劑的選擇

實驗對比了中性氧化鋁、硅膠、C18、PSA、GCB和NH2等6種分散固相萃取劑。中性氧化鋁主要是對目標(biāo)物進行物理吸附，PSA和NH2對去除樣品中的糖類雜質(zhì)有較好效果，GCB則可以對具有平面結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)進行吸附，雖然加入后，對基質(zhì)效應(yīng)有一定的改善，但同時也對目標(biāo)物有較嚴(yán)重的吸附作用，因此回收率較低。而硅膠相對于其他分散固相萃取劑，對氟他胺和羥基氟他胺的吸附較少，C18對氟他胺和羥基氟他胺的影響最小，氟他胺和羥基氟他胺回收率均在90%以上，因此最終選擇C18進行凈化，不同分散固相萃取劑的回收率見圖3。

圖3 不同凈化劑對回收率的影響圖

進一步對C18用量進行優(yōu)化，當(dāng)用量為100～150 mg時，回收率較高，本實驗選擇100 mg為最佳用量，結(jié)果詳見圖4。

圖4 不同凈化劑用量對回收率的影響圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

直接提取的方式會使液態(tài)乳中的氨基酸、脂肪等物質(zhì)提取至有機層，雖然方法使用了固相萃取劑進行凈化，但氨基酸、脂肪等雜質(zhì)的數(shù)量級要遠(yuǎn)大于目標(biāo)化合物，因此很可能會存在基質(zhì)效應(yīng)，從而影響對數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。實驗為了探究基質(zhì)效應(yīng)，使用空白基質(zhì)液配制基質(zhì)曲線，以其斜率與純?nèi)軇┣€的斜率之比為判定依據(jù)。結(jié)果顯示，氟他胺呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為95.07%，在80%～120%，屬于可接受范圍。但羥基氟他胺呈現(xiàn)基質(zhì)增強效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為133.6%，對定量產(chǎn)生影響，所以用空白基質(zhì)配制曲線進行定量。

2.5 線性關(guān)系和檢出限

以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進行曲線擬合，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)R2。由表2可知，氟他胺和羥基氟他胺的曲線在1.0～100.0 μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.999。同時，通過低濃度加標(biāo)，按信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10），測得氟他胺和羥基氟他胺的方法檢出限均為2.0 μg·kg-1，定量限均為5.0 μg·kg-1，方法靈敏度較高，能滿足測定要求。

表2 氟他胺和羥基氟他胺的線性方程、檢出限和定量限表

2.6 回收率與精密度實驗

以5.0 μg·kg-1、10 μg·kg-1、25 μg·kg-1的濃度水平進行加標(biāo)回收實驗，每個不同的添加水平于同一天內(nèi)平行測定6次，并計算出相應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。氟他胺和羥基氟他胺的平均回收率在94.8%～108.0%，RSD在1.58%～5.58%的范圍內(nèi)，說明在基質(zhì)曲線校正定量的情況下，方法的回收率好。數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 不同水平的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

3 結(jié)論

本文采用分散固相萃取對提取液進行凈化，通過配制基質(zhì)曲線校正定量結(jié)果，對牛奶中的氟他胺和羥基氟他胺準(zhǔn)確定性定量；結(jié)合飛行時間質(zhì)譜測得精確分子量，對氟他胺和羥基氟他胺有較強的選擇性，定性能力更為精確，相對于一般的串聯(lián)質(zhì)譜法，可排除假陽性情況的出現(xiàn)；回收率實驗的結(jié)果表明，方法回收率好，精密度高。該方法對日常液態(tài)乳中氟他胺和羥基氟他胺的快速篩查和定量分析有較好的適用性，建立一個高通量篩查乳制品中人工喂養(yǎng)的雌激素或類雌激素的方法，對乳制品的質(zhì)量安全監(jiān)管有重大的意義。