顯微共焦拉曼光譜技術(shù)在復(fù)雜未知物測(cè)定上的應(yīng)用

隨著對(duì)食品、化工、生物和環(huán)境等領(lǐng)域研究的不斷深入，需要分析的研究對(duì)象呈現(xiàn)出多樣性和復(fù)雜性，因此關(guān)于未知物質(zhì)的測(cè)定和分析問(wèn)題備受關(guān)注。光譜分析技術(shù)是現(xiàn)代分析技術(shù)的重要組成部分，光譜分析技術(shù)一般包括發(fā)射光譜法、吸收光譜法和散射光譜法。當(dāng)一束光照射在樣品上時(shí)，一般會(huì)發(fā)生反射、透射和散射。當(dāng)散射光頻率和入射光頻率相同時(shí)為瑞利散射，還有一小部分（通常約為千萬(wàn)分之一）散射光頻率發(fā)生變化，這部分散射光稱為拉曼散射。拉曼散射效應(yīng)是由印度物理學(xué)家拉曼（C.V.Raman）于1928年發(fā)現(xiàn)并予以證實(shí)，拉曼利用汞弧燈光照射液體苯并觀察其散射光時(shí)，發(fā)現(xiàn)了光的非彈性散射現(xiàn)象。為紀(jì)念他的貢獻(xiàn)，人們以其名字命名為拉曼散射。光在與樣品材料的振動(dòng)過(guò)程中發(fā)生了能量交換，拉曼光譜通過(guò)峰的位置、強(qiáng)度和形狀，反映出分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)頻率，從而得到樣品物質(zhì)的化學(xué)和結(jié)構(gòu)方面的信息。拉曼光譜作為一種可以對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行“指紋”識(shí)別的光譜技術(shù)，具有分辨率高、鑒別力強(qiáng)等特點(diǎn)，使得拉曼光譜成為探測(cè)樣品振動(dòng)的有力工具。目前，拉曼光譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)的研究及物質(zhì)的鑒定[1-4]。

隨著拉曼光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開發(fā)出了一些新的拉曼光譜技術(shù)，如表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）、共焦顯微拉曼光譜技術(shù)（Confocal Micrographic Raman Spectroscopy，CMRS）、共振拉曼光譜技術(shù)（Resonance Raman Spectroscopy，RRS）和傅立葉轉(zhuǎn)換拉曼光譜技 術(shù)（Fourier Transform Raman Spectroscopy，F(xiàn)T-Raman）。1990年G.J.Puppels等在Nature雜志上報(bào)道其發(fā)明的激光共焦拉曼光譜顯微技術(shù)，是拉曼技術(shù)的一次革命性的突破。共焦拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜技術(shù)和顯微分析技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種應(yīng)用技術(shù)，顯微共焦拉曼光譜儀將拉曼光譜儀和光學(xué)顯微鏡耦合在一起，通過(guò)不同倍數(shù)物鏡觀察樣品的形貌特征，并通過(guò)共焦針孔實(shí)現(xiàn)空間濾波功能，將激光光斑聚焦在樣品上進(jìn)行拉曼測(cè)量，該方法具有高靈敏度和高分辨率的優(yōu)點(diǎn)[5]。目前已成為食品[6]、制藥[7]、材料[8]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[9]、半導(dǎo)體[10]、司法刑偵[11]和珠寶鑒定[12]等分析領(lǐng)域的重要觀測(cè)手段之一。本文利用顯微共焦拉曼光譜技術(shù)，對(duì)葡萄糖發(fā)酵后的兩種復(fù)雜未知產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，探討檢測(cè)未知物質(zhì)的方法，擬為復(fù)雜未知物質(zhì)的鑒定提出一種檢測(cè)思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

inVia? Reflex顯微共焦拉曼光譜儀，英國(guó)雷尼紹公司，儀器參數(shù)：激發(fā)光源波長(zhǎng)532 nm和785 nm，掃描范圍100～4 000 cm-1，分辨率1 cm-1。

1.2 試驗(yàn)方法

取適量待測(cè)樣品放置在載玻片上，壓實(shí)后置于顯微鏡載物臺(tái)上，選取5X和長(zhǎng)焦50X物鏡鏡頭觀察樣品形貌，選擇合適測(cè)試區(qū)域，聚焦后進(jìn)行拉曼光譜的采集。因待測(cè)樣品為未知物質(zhì)，分別用532 nm和785 nm激光器激發(fā)拉曼光譜，用不同激光功率和采集時(shí)間確定最佳試驗(yàn)參數(shù)。檢測(cè)過(guò)程中，從小到大逐漸嘗試最適宜的激光功率。本文建立的檢測(cè)條件如表1所示。

表1 樣品檢測(cè)條件表

1.3 試驗(yàn)樣品

兩種待測(cè)樣品為未知葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)物，分別命名為樣品A和樣品B。如圖1所示，兩種待測(cè)樣品均為粉末狀固體，樣品A（圖左上）呈現(xiàn)紅棕色，樣品B（圖右上）呈現(xiàn)灰白色。中間左圖為樣品A在5X鏡頭下形貌，中間右圖為樣品B在5X鏡頭下樣品形貌。圖左下為樣品A在長(zhǎng)焦50X鏡頭下形貌，圖右下為樣品B在長(zhǎng)焦50X鏡頭下形貌。

圖1 顯微鏡鏡頭下樣品形貌圖

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

圖2（a）為樣品A在532 nm激光器條件下的拉曼譜圖，在不同功率激光照射、不同采集時(shí)間條件下均得到類似譜圖。由圖可知，樣品A在激光激發(fā)下產(chǎn)生強(qiáng)熒光，熒光背景太強(qiáng)使探測(cè)器飽和，熒光信號(hào)湮沒(méi)了拉曼信號(hào)，CCD探測(cè)器探測(cè)不到拉曼信號(hào)。圖2（b）為樣品A在785 nm激光器條件下的譜圖，對(duì)比圖2（a）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，得到的譜圖與532 nm激光器激發(fā)的結(jié)果類似，熒光背景太強(qiáng)，CCD探測(cè)器飽和，無(wú)法探測(cè)到拉曼信號(hào)。當(dāng)試驗(yàn)條件為532 nm激光器、激光功率25 mW和785 nm激光器、激光功率125 mW時(shí)，樣品被激光燒壞。

圖2 樣品A拉曼光譜圖

圖3（a）為樣品B在532 nm激光器照射、激光功率0.05 mW條件下的拉曼譜圖，圖3（b）為將激光功率增大后得到的樣品B的拉曼譜圖。由圖可知，樣品B在弱激光功率激光照射下，熒光強(qiáng)度高，無(wú)特征峰出現(xiàn)，增大激光功率后仍產(chǎn)生強(qiáng)熒光，CCD探測(cè)器飽和，探測(cè)器探測(cè)不到拉曼信號(hào)。圖4為樣品B在785 nm激光器照射下的譜圖，在不同功率激光照射、不同采集時(shí)間條件下均得到類似譜圖。試驗(yàn)結(jié)果與532 nm激光器激發(fā)的結(jié)果類似，熒光背景太強(qiáng)，且無(wú)特征峰出現(xiàn)。

圖3 樣品B在532 nm激光器條件下拉曼光譜圖

圖4 樣品B在785 nm激光器條件下拉曼光譜圖

通過(guò)強(qiáng)激光長(zhǎng)時(shí)間照射漂白，持續(xù)照射樣品1 min以上，利用物質(zhì)的“熒光褪色效應(yīng)”消除熒光干擾。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品A和樣品B在強(qiáng)激光照射下被燒壞，如圖5（a）和5（b）所示，表明均不適用利用“光漂白”現(xiàn)象來(lái)減小熒光干擾。

圖5 樣品被燒壞圖

綜合分析結(jié)果可知，樣品A和樣品B在不同功率的激光激發(fā)下均產(chǎn)生了強(qiáng)熒光，掩蓋了拉曼信號(hào)，并且不適用通過(guò)強(qiáng)激光長(zhǎng)時(shí)間照射來(lái)消除熒光背景。后續(xù)試驗(yàn)可嘗試通過(guò)進(jìn)一步純化樣品、加入熒光猝滅劑、改變激光器光源等方式減弱或消除熒光對(duì)樣品拉曼光譜的干擾。

3 結(jié)論

復(fù)雜未知物的測(cè)定是食品分析檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一，其中往往含有非常豐富的化學(xué)組分，給拉曼光譜的解析帶來(lái)了困難。目前很多研究人員將拉曼光譜技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用，以期彌補(bǔ)拉曼光譜技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中的缺陷，提高檢測(cè)的靈敏度和表征的完整性。

熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，普遍存在于拉曼光譜采集過(guò)程中，拉曼光和熒光都是在激光激發(fā)下產(chǎn)生的，有效消除熒光背景的影響，得到準(zhǔn)確、可靠的拉曼譜圖，是進(jìn)行拉曼光譜采集的關(guān)鍵問(wèn)題。部分物質(zhì)的拉曼光譜熒光背景較強(qiáng)，可通過(guò)更改激光波長(zhǎng)、純化樣品、加入熒光猝滅劑等方式減弱熒光對(duì)拉曼光譜的影響。需要注意的是，在檢測(cè)過(guò)程中要合理控制激光功率，從弱到強(qiáng)選擇出最適宜的激光功率，避免激光對(duì)樣品產(chǎn)生不可逆的損害。由于樣品物質(zhì)的復(fù)雜性，本研究未能對(duì)樣品進(jìn)行純化，以及因激光器波長(zhǎng)的局限性未能找到合適的消除熒光干擾的方法，這也是今后對(duì)未知物測(cè)定開展進(jìn)一步研究的方向。針對(duì)復(fù)雜未知樣品的測(cè)定，通過(guò)合適的方式消除熒光背景的干擾，拉曼光譜技術(shù)仍是解決復(fù)雜未知樣品結(jié)構(gòu)分析的有力工具。