左歸丸對(duì)早衰和初老大鼠下丘腦-垂體-卵巢FSHR、LHR和ER表達(dá)的影響

趙粉琴，趙艷，劉潔穎，茍雅姣，胡芝霞

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO)調(diào)控卵巢的生殖和內(nèi)分泌功能，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRHa)，促進(jìn)垂體前葉分泌促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)，F(xiàn)SH的生物學(xué)作用主要是促進(jìn)卵巢卵泡的生長(zhǎng)和卵泡顆粒細(xì)胞的增生，刺激卵泡細(xì)胞上LH受體產(chǎn)生；LH的生物學(xué)作用主要是促進(jìn)卵泡的成熟和排卵，刺激卵泡內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生雌激素，維持女性?xún)?nèi)分泌。

FSHR和LHR主要存在于卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞，是促性腺激素(Gn)及各類(lèi)細(xì)胞因子調(diào)控卵泡發(fā)育、成熟及排卵的重要受體，GnRHa能抑制FSH對(duì)FSHR的誘導(dǎo)[1]，從而使卵巢FSHR表達(dá)及FSHR與FSH的結(jié)合量減少[2]，影響卵泡的發(fā)育和成熟,但是在FSHR和LHR下丘腦和垂體組織的表達(dá)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。左歸丸作為經(jīng)典補(bǔ)腎藥[3]，在防治生理性或功能性卵巢功能衰退(POF)方面研究較多，對(duì)下丘腦-垂體-卵巢激素受體表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道?；诖吮狙芯繉?duì)不同階段大鼠體內(nèi)血清(FSH、LH和E2)水平變化以及在下丘腦、垂體、卵巢不同部位表達(dá)的差異性以及左歸丸的干預(yù)作用進(jìn)行研究，驗(yàn)證左歸丸促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF級(jí)SD大鼠，4～6月齡(青年,相對(duì)于人18～20歲)60只，11～12月齡(初老,相對(duì)于人40～45歲)40只，體質(zhì)量(220±20)g。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。普通飲食、飲水，室溫18～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，自然晝夜節(jié)律光照。

1.2 主要藥品和試劑

順鉑注射液(云南植物藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H53021740)；補(bǔ)佳樂(lè)(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130009)；性激素ELSIA試劑盒，LH(MM-0624R1)、FSH(MM-0566R1)、E2(MM-0575R1)均來(lái)自江蘇菲亞生物科技有限公司；一抗(GeneTex)：LHR(GTX64387,稀釋比例為1∶100，抗兔)，F(xiàn)SHR(GTX64391，稀釋比例為1∶100，抗兔)，ER(GTX22746，稀釋比例為1∶100，抗鼠)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋)；二抗(中杉金橋)：生物素標(biāo)記山羊抗鼠IgG(SP-9002)，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(SP-9001)；三抗(中杉金橋)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(SP-9001)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備、分組以及給藥

青年大鼠60只給予順鉑注射液6 mg/(kg·w)，共2次，建立卵巢早衰大鼠模型?？瞻捉M給予等劑量的生理鹽水腹腔注射。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、模型+補(bǔ)佳樂(lè)組、模型+左歸丸(低、中、高)劑量組,每組10只；另40只初老大鼠，隨機(jī)分成空白組，初老+左歸丸(低、中、高)劑量組，每組10只。補(bǔ)佳樂(lè)灌胃藥物劑量0.09 g/(kg·d)，制備成0.09 mg/mL；左歸丸劑量9.45 g/(kg·d)，制備左歸丸濃度煎劑為0.945 g生藥/mL，低劑量0.472 5 g生藥/mL,中劑量0.945 g生藥/mL,高劑量4.725 g生藥/mL。左歸丸組成為熟地黃、炒山藥、山萸肉、牡丹皮、澤瀉、茯苓，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，每只大鼠灌胃2 mL/d，連續(xù)用藥21 d。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 大鼠血清性激素水平的檢測(cè)

治療結(jié)束后，心前區(qū)取血1.5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清移入EP管，用96孔ELISA試劑盒檢測(cè)血清中FSH、E2和LH水平。

1.4.2 免疫組化法檢測(cè)大鼠下丘腦、垂體、卵巢組織中FSHR、LHR、ER蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠，分離下丘腦、垂體、卵巢，切片，脫水。3 %過(guò)氧化氫室溫避光作用20 min。正常山羊血清封閉液室溫作用30 min。倒去封閉液，滴加一抗(FSHR或LHR或ER)工作液(1∶100)，4 ℃ 孵育過(guò)夜。分別滴加生物素化二抗(SP試劑盒)、三抗，分別室溫作用30 min，再滴加DAB顯色液(1∶20)，室溫避光作用5 min，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，一旦出現(xiàn)最佳顏色，使用蒸餾水停止其顯色反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。同時(shí)設(shè)染色對(duì)照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同區(qū)域。使用Image-Pro Plus軟件(6.0版)測(cè)量卵巢內(nèi)組織中FSHR、LHR、ER陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(IOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清FSH、LH和E2含量變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中除正常組以外，其余各組有大鼠死亡。與空白組比較，早衰模型組大鼠血清FSH增高(P<0.01)，LH增高，E2降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，模型+左歸丸高劑量組降低大鼠血清FSH水平(P<0.01)；與初老組比較，初老組+左歸丸高劑量組降低大鼠血清FSH水平(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清FSH、LH和E2含量

2.2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR、LHR和ER表達(dá)分析

2.2.1 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR表達(dá)分析

與空白組比較，模型組、初老組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR表達(dá)下降(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、模型+左歸丸高劑量組、初老+左歸丸高劑量組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織的FSHR表達(dá)增加(P<0.01，P<0.05)；與初老組比較，初老+左歸丸高劑量組明顯增加下丘腦、垂體、卵巢組織FSHR表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2，圖1。

表2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位FSHR表達(dá)分析

圖1 下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR免疫組化表達(dá) (×400)

2.2.2 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位LHR表達(dá)分析

與空白組比較，模型組、初老組大鼠下丘腦和垂體組織LHR表達(dá)下降(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組、模型+左歸丸(中、低劑量組)和初老+左歸丸低劑量組大鼠下丘腦和垂體組織LHR表達(dá)明顯降低(P<0.01)，而模型+左歸丸高劑量組和初老+左歸丸高劑量組大鼠下丘腦、垂體和卵巢組織LHR表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與初老組比較，左歸丸(高、中劑量組)明顯增加大鼠垂體組織LHR表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖2。

表3 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位LHR表達(dá)分析

2.2.3 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位ER表達(dá)分析

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦和卵巢組織、初老組大鼠下丘腦和垂體組織ER表達(dá)下降(P<0.01)；與模型組比較，初老組、模型+左歸丸高劑量組和初老+左歸丸(高劑量)低大鼠下丘腦、模型+左歸丸(高、中劑量組)和初老+左歸丸(高、中、低劑量組)大鼠垂體和卵巢組織ER表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與初老組比較，初老組+左歸丸(高、中、低劑量組)大鼠垂體組織ER表達(dá)明顯增加(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4，圖3。

表4 各組大鼠下丘腦-垂體-卵巢部位ER表達(dá)分析

圖3 下丘腦、垂體和卵巢組織ER免疫組化表達(dá)(×400)

3 討論

POF主要是卵泡數(shù)量減少，雌激素水平下降，出現(xiàn)一系列近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響女性生殖、生命健康[4]。女性生殖和內(nèi)分泌功能由HPO軸的正負(fù)反饋調(diào)控，F(xiàn)SH和LH，優(yōu)先激活它們?cè)谙虑鹉X-垂體-卵巢-子宮性腺軸中的同源受體發(fā)揮重要作用[5-6]，促進(jìn)卵泡發(fā)育、成熟以及排卵，同時(shí)卵泡發(fā)育合成的E2，與其富含ER的下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織[7]結(jié)合發(fā)揮作用[3]。所有激素在體內(nèi)生理作用的強(qiáng)弱，除了與生物效應(yīng)量呈正比，還受激素受體(R)活性度高低的影響[8]。

FSHR和LHR對(duì)卵巢卵泡的發(fā)育、成熟以及排卵起著重要調(diào)控作用，而且不受外源性雌激素含量的影響[9]。關(guān)于雌激素及其受體結(jié)合，在生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等發(fā)揮重要作用的報(bào)道很多[10-11]，尤其是FSHR和LHR是卵巢顆粒細(xì)胞膜表面的重要受體，兩者的表達(dá)水平與卵母細(xì)胞的成熟程度呈現(xiàn)正相關(guān)[12]，在相同年齡的情況下，ER水平低下其卵巢衰老更快，其功能退化更為明顯，反作用于腺垂體，腺垂體減少促卵泡素分泌[13]。研究認(rèn)為FSHR 的缺陷會(huì)導(dǎo)致受體結(jié)合FSH 以及信號(hào)傳導(dǎo)的異常，配子生成障礙，導(dǎo)致不孕[14],因而研究卵巢功能早衰(POF)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸上FSH受體(FSHR)、LH受體(LHR)以及雌激素受體(ER)含量變化就顯得尤為重要。

本研究采用順鉑腹腔注射致POF[15]，血清性激素水平結(jié)果顯示，早衰大鼠和初老大鼠血清FSH增高(P<0.05),LH增高，E2含量降低，但各組雌激素水平比較之間無(wú)差異(P>0.05)，因?yàn)榇萍に夭皇桥袛嗦殉补δ芩ネ说闹饕笜?biāo)[16]。經(jīng)治療后發(fā)現(xiàn)左歸丸能減少早衰和初老大鼠FSH和LH分泌，升高E2水平，促進(jìn)各級(jí)卵泡發(fā)育，達(dá)到改善卵巢功能的目的，尤以左歸丸高劑量組作用顯著(P<0.05)。

通過(guò)免疫組化的組織病理學(xué)研究顯示，早衰大鼠和初老組大鼠下丘腦組織中FSHR和LHR表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而初老組大鼠ER表達(dá)沒(méi)有下降。早衰大鼠和初老組大鼠垂體組織中LHR表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而早衰大鼠FSHR沒(méi)有明顯變化，ER表達(dá)下降(P<0.05)；初老組大鼠FSHR表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而ER沒(méi)有明顯變化。在卵巢組織早衰大鼠FSHR和ER表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而LHR沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明卵巢功能衰退FSH和LH效應(yīng)組織的相應(yīng)FSHR和LHR含量表達(dá)減少早于雌激素受體。這與研究卵巢上位腺體功能的異常可能先于卵巢功能的衰退有關(guān)，與血清雌激素水平無(wú)關(guān)一致[17]。

因?yàn)橄虑鹉X是雌激素正負(fù)反饋?zhàn)饔靡约按贵w負(fù)反饋?zhàn)饔玫男?yīng)器，早衰和初老大鼠血清FSH和LH水平升高，雌激素水平下降，進(jìn)而反饋性影響下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR、LHR和ER含量，F(xiàn)SH、LH和雌激素作用強(qiáng)度降低，卵母細(xì)胞停止發(fā)育及閉鎖，雌激素合成下降，即POF狀態(tài)。

左歸丸作為經(jīng)典補(bǔ)腎養(yǎng)血方劑，具有填精益髓功效[18]，切合腎主生殖，腎精虧虛乃天癸竭，形壞而無(wú)子之病機(jī)。本研究顯示左歸丸能上調(diào)下丘腦、垂體和卵巢組織FSHR和ER表達(dá)，提高FSH和雌激素作用效度，改善卵巢功能的作用。這可能與左歸丸有類(lèi)雌激素樣作用，并能增加雌激素效應(yīng)組織受體含量，促進(jìn)雌激素與其特異性受體的結(jié)合，改善卵巢功能，同時(shí)是否與左歸丸有改善化療引起的氧化應(yīng)激損傷，延緩衰老有關(guān)[19]。