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    異煙肼溫敏型原位凝膠處方優(yōu)化、體外釋放及藥代動(dòng)力學(xué)分析

    2022-10-12 07:24:54倪堅(jiān)軍周中元蔡鑫君
    浙江醫(yī)學(xué) 2022年17期
    關(guān)鍵詞:溫敏異煙肼膠凝

    倪堅(jiān)軍 周中元 蔡鑫君

    結(jié)核病由結(jié)核桿菌感染引起,主要侵襲患者肺部,故又稱(chēng)為肺結(jié)核[1-2]。肺結(jié)核患者中,約45.5%~63.3%合并支氣管內(nèi)膜結(jié)核,由于臨床表現(xiàn)不明顯,誤診、漏診率高,易造成不可逆性支氣管狹窄,嚴(yán)重者將造成呼吸困難、肺不張及繼發(fā)性肺炎等惡性結(jié)局[3-5]。支氣管結(jié)核病灶伴有廣泛纖維增生,周?chē)芊植枷∩?,血運(yùn)不良,嚴(yán)重影響藥物的滲入,藥物治療效果不佳[6-8]。而原位凝膠不需要有機(jī)溶劑或共聚反應(yīng)試劑,組織相容性良好,具有生物黏附性及溶液-半固態(tài)凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)等特點(diǎn),且制作工藝簡(jiǎn)便、應(yīng)用方便、在用藥部位滯留時(shí)間長(zhǎng)及有良好緩釋作用,近年來(lái)已被選擇作為諸多藥物載體[9-10]。異煙肼是抗結(jié)核治療藥物的首選,為克服結(jié)核患部血供不足、藥物難以進(jìn)入、難以達(dá)到抗結(jié)核治療有效藥物濃度的困難[11-12],本研究以泊洛沙姆188(P188)和泊洛沙姆407(P407)為輔料,制備異煙肼溫敏型原位凝膠,用于經(jīng)纖維支氣管鏡介入治療給藥,以提高異煙肼在結(jié)核病灶中的停留時(shí)間和藥物濃度,為支氣管結(jié)核的臨床治療提供新思路。

    1 材料和方法

    1.1 材料BALB/c小鼠,雄性,4~6周齡,(20±2)g;SD大鼠,雄性,約250 g;兩者均購(gòu)自上海斯萊克公司,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一飼養(yǎng),(22±2)℃,濕度50%~60%,14 h光照/10 h黑暗,換風(fēng)15~20次/h。異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):100578- 201502;異煙肼原料藥購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):R21A6T1;P188(批號(hào):WPDI608B)、P407(批號(hào):WPMI556B)、透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量8 000~14 000,型號(hào):MD34)購(gòu)自上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司;熒光標(biāo)志物Cy5.5 NHS ester購(gòu)自杭州邦易化工有限公司,批號(hào):H1824065。

    1.2 方法

    1.2.1 異煙肼溫敏型原位凝膠制備及膠凝溫度測(cè)定采用冷溶法[13]制備異煙肼溫敏型原位凝膠。稱(chēng)取處方量的異煙肼、P407和P188,加入適量純化水使溶解,混合均勻;4℃放置24 h,充分溶脹后去除氣泡,得到澄清透明、分散均勻的異煙肼溫敏型原位凝膠。采用倒置法[14]測(cè)定膠凝溫度。制備好的異煙肼溫敏型原位凝膠溶液置于西林瓶中,在水浴中慢慢加熱,水浴溫度從35℃開(kāi)始以1℃/min速度升溫,每升溫1℃即取出西林瓶,倒置觀察是否形成凝膠,直到西林瓶中的所有溶液全部變成凝膠,記錄此時(shí)溫度,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

    1.2.2 原位凝膠處方的優(yōu)化采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)異煙肼溫敏型原位凝膠處方進(jìn)行優(yōu)化。以P407、P188的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量(A和B),取值范圍分別為20%~30%和0~6%;以膠凝溫度(T)為因變量。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理,兩因素一指標(biāo)時(shí),每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平,分別為±α、±1和0(α=1.414),見(jiàn)表1。采用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行二元多項(xiàng)式回歸方程擬合,軟件擬合的回歸方程為T(mén)=132.823-6.464A+1.992B+0.066AB+0.088A2-0.364B2(R2=0.947 1),各項(xiàng)方差分析結(jié)果顯示模型P<0.01時(shí)認(rèn)為該模型可靠有效。

    表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

    采用Design-Expert 10.0.3軟件生成二維等高線圖,得到備選處方;利用1.2.1方法制備異煙肼溫敏型原位凝膠并測(cè)定膠凝溫度,與預(yù)測(cè)值比較,計(jì)算偏差=(預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%。偏差最小的處方確定為最優(yōu)處方。

    1.2.3 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼含量測(cè)定采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)法測(cè)定異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼的含量。色譜條件:Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.02 mol/L磷酸氫二鈉(pH 6.0)-甲醇(體積比85∶15),流速1.0 ml/min,柱溫35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)262 nm,進(jìn)樣量10 μl。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正離子模式;以350℃氮?dú)庾鳛楦稍餁?,控制流速及霧化器壓力分別為12 ml/min,241.3 kPa,毛細(xì)管及解離能量分別為4 000 V及100 eV,碰撞能量36 eV及28 eV。在多反應(yīng)檢測(cè)模式下檢測(cè)離子濃度,停留時(shí)間設(shè)置為550 ms。利用異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品制備1.015 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用流動(dòng)相分別稀釋成1015.00、507.50、304.50、203.00、101.50、81.20、60.90、40.60、20.30、10.15 mg/L的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用LC-MS/MS法分別檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積,建立異煙肼質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用LC-MS/MS方法測(cè)定優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算凝膠中異煙肼質(zhì)量濃度。

    1.2.4 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)精密移取高(1 000 mg/L)、中(90 mg/L)、低(8 mg/L)3個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液,采用LC-MS/MS測(cè)定各對(duì)照品溶液的峰面積,連續(xù)測(cè)定5 d,計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。精密配制異煙肼原位凝膠溶液,濃度約為110 mg/L共5份,檢測(cè)每份樣品的峰面積,分析該測(cè)定方法的重復(fù)性。檢測(cè)同一份異煙肼原位凝膠溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面積,考察異煙肼原位凝膠溶液的穩(wěn)定性。重復(fù)性、精密度等試驗(yàn)要求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)不超過(guò)2.0%。

    1.2.5 異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋放試驗(yàn)精密吸取5 ml異煙肼溫敏型原位凝膠加入透析袋內(nèi),扎緊袋口,放入裝有100 ml PBS[pH 7.4,(37±1)℃]溶液的廣口瓶中。采用LC-MS/MS法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)(15、30、45、60、75、90、120、150、180、240、270、300 min)PBS溶液中異煙肼的濃度,計(jì)算相對(duì)累積釋放率。以異煙肼水溶液為對(duì)照。利用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Weibull方程等對(duì)異煙肼溫敏型原位凝膠體外溶蝕曲線進(jìn)行擬合。

    1.2.6 異煙肼溫敏型原位凝膠藥效學(xué)研究采用小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)。取6只BALB/c小鼠,隨機(jī)分成A組和B組,每組3只。A組使用Cy5.5 NHS ester標(biāo)記的異煙肼溫敏型原位凝膠,B組使用Cy5.5 NHS ester標(biāo)記的異煙肼水溶液。利用氣管注射給藥,20 μl/只,具體操作如下:小鼠麻醉后,嘴巴張開(kāi)固定,將Exel SafeletⅣ導(dǎo)管插入氣管,取出導(dǎo)管上的針頭,將小鼠移入生物安全柜,用吸管將異煙肼原位凝膠或異煙肼水溶液注入導(dǎo)管開(kāi)口,小鼠吸入凝膠或水溶液后,取出導(dǎo)管,將小鼠置于加熱燈下恢復(fù)。給藥完成后觀察小鼠狀態(tài),于0、0.5、1、2、4、7、72 h時(shí)拍攝,檢測(cè)Cy5.5 NHS ester熒光分布、強(qiáng)度及小鼠生理情況。

    1.2.7 異煙肼溫敏型原位凝膠藥動(dòng)學(xué)研究取10只SD大鼠隨機(jī)分為A組和B組,每組5只。A組使用異煙肼溫敏型原位凝膠,B組使用異煙肼水溶液,氣管注射給藥,注射劑量為16 mg/kg(按異煙肼劑量計(jì)算),200 μl/只。分別于給藥后15、30、60、120、180、240、360 min時(shí)眼眶取血,離心后取上層血漿,利用LC-MS/MS法檢測(cè)兩組大鼠血漿中異煙肼質(zhì)量濃度,繪制血漿異煙肼質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線圖,利用WinNolin軟件計(jì)算異煙肼溫敏型原位凝膠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

    1.2.8 大鼠血樣中異煙肼含量的測(cè)定利用LC-MS/MS法,色譜條件與1.2.3一致。精密稱(chēng)取異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg,用純化水溶解,定容至10 ml,制成1.005 g/L的儲(chǔ)備液,將儲(chǔ)備液分別稀釋為10.05、20.10、40.20、100.50、201.00、502.50 mg/L的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)液。精密量取空白血漿200 μl于離心管,再加l00 μl上述不同濃度的異煙肼標(biāo)準(zhǔn)液,加700 μl甲醇沉淀蛋白,配制成濃度為1.005、2.010、4.020、10.05、20.10、50.25 mg/L的溶液。將上述溶液旋渦混合1 min后,用高速離心機(jī)(5 000 r/min)離心8 min后,取上清液,過(guò)0.22 μm的濾膜后,進(jìn)樣。利用測(cè)得峰面積與配制的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度計(jì)算線性回歸方程。精密量取樣品血漿100 μl于離心管,加400 μl甲醇沉淀蛋白,旋渦混合1 min后,用高速離心機(jī)(5 000 r/min)離心8 min后,取上清液,過(guò)0.22 μm的濾膜。利用LCMS/MS法測(cè)定大鼠血漿的峰面積,計(jì)算大鼠血漿中的異煙肼含量。精密度、重復(fù)性、回收率實(shí)驗(yàn)參考1.2.4。精密度、重復(fù)性、回收率等試驗(yàn)要求RSD不超過(guò)2.0%。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t或SNK-q分析。采用Design-Expert 10.0.3軟件繪制自變量與因變量三維曲面圖及等值線圖。采用WinNonlin 6.4軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 異煙肼原位凝膠最優(yōu)處方的選擇當(dāng)P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)恒定時(shí),隨著P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大,膠凝溫度逐漸下降;當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)恒定時(shí),隨著P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大,膠凝溫度逐漸升高,見(jiàn)圖1。以略低于人體體溫的35℃作為膠凝溫度,生成3個(gè)優(yōu)化處方:處方1中P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%、P188為3.5%;處方2中P407為24.0%、P188為2.2%;處方3中P407為23.0%、P188為1.3%。利用篩選出的3個(gè)處方制備異煙肼溫敏型原位凝膠,測(cè)定膠凝溫度,并利用回歸方程擬合對(duì)應(yīng)的膠凝溫度。結(jié)果顯示,處方1即P407為25.0%、P188為3.5%時(shí),膠凝溫度偏差最小,即處方1為最優(yōu)處方,見(jiàn)表2。

    表2 異煙肼溫敏型原位凝膠處方膠凝溫度驗(yàn)證

    圖1 P407、P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠凝溫度的影響(a:等高線圖;b:維曲面圖)

    2.2 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠中異煙肼質(zhì)量濃度測(cè)定LC-MS/MS法測(cè)定優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的含量,以A為峰面積,C為藥物濃度,得到線性回歸方程為A=17.221C-1.949 1(R2=1.000 0)。精密度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高(1 000 mg/L)、中(90 mg/L)、低(8 mg/L)3個(gè)濃度的異煙肼溶液RSD分別為0.103%、0.272%、0.471%;重復(fù)性考察發(fā)現(xiàn)檢測(cè)5份相同濃度的異煙肼溶液的RSD為0.550%,說(shuō)明建立的方法符合方法學(xué)要求。穩(wěn)定性檢查發(fā)現(xiàn)檢測(cè)同一份異煙肼原位凝膠溶液放置0、1、2、4、8、12、24 h后的峰面積RSD為0.210%,表明制備的異煙肼溫敏型原位凝膠的含量在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.3 優(yōu)化處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋藥比較異煙肼水溶液在60 min時(shí)藥物已基本釋放完全,累積釋放百分率為94.40%;優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠在30 min時(shí),累積釋放百分率為55.18%,120 min后釋藥曲線漸趨平穩(wěn),累積釋放百分率為81.90%,300 min時(shí)累積釋放百分率為84.35%,見(jiàn)圖2。

    圖2 異煙肼水溶液和異煙肼溫敏型原位凝膠的體外釋放曲線

    2.4 異煙肼溫敏型原位凝膠的藥效學(xué)氣管注射后,兩組小鼠狀態(tài)良好,均未出現(xiàn)因阻塞氣道致死的情況。小鼠給藥后0、0.5、1、2、4、7、72 h的活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,A組小鼠體內(nèi)的Cy5.5 NHS ester熒光信號(hào)較B組小鼠強(qiáng)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),兩組小鼠體內(nèi)的熒光信號(hào)均逐漸降低,但A組降低速度慢于B組。給藥后0.5~4 h兩組小鼠熒光信號(hào)強(qiáng)度差異最大。檢測(cè)熒光信號(hào)分布情況發(fā)現(xiàn),兩組熒光信號(hào)定位都較為準(zhǔn)確,表明注射的藥物未出現(xiàn)脫離給藥部位情況,見(jiàn)圖3。

    2.5 異煙肼溫敏型原位凝膠的藥動(dòng)學(xué)以A為峰面積,C為藥物濃度,使用LC-MS/MS法建立的線性回歸方程為A=28.476C-16.45(R2=0.999),線性范圍為1.005~50.250 mg/L。精密度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高(50.250 mg/L)、中(10.050 mg/L)、低(2.010 mg/L)3個(gè)濃度的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD分別為0.70%、1.20%、0.83%,重復(fù)性考察發(fā)現(xiàn)檢測(cè)5份相同濃度的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD為1.050%,說(shuō)明建立的方法符合方法學(xué)要求?;厥章蕦?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精密移取適量的高、中、低質(zhì)量濃度的異煙肼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液,回收率平均為98.26%,RSD為1.610%。說(shuō)明該方法適用于血漿中異煙肼含量的測(cè)定。

    LC-MS/MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩組大鼠體內(nèi)異煙肼的藥物濃度均在給藥后30 min達(dá)峰,峰濃度分別為(40.28±0.43)和(6.35±0.63)mg/L(P<0.05);隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng),兩組大鼠體內(nèi)異煙肼濃度逐漸降低,見(jiàn)圖4。計(jì)算兩組大鼠體內(nèi)異煙肼的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組大鼠體內(nèi)異煙肼的AUC0-∞是B組的2.82倍,B組的異煙肼清除率(CL)是A組的1.41倍,見(jiàn)表3。

    表3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

    圖4 異煙肼濃度-時(shí)間曲線

    3 討論

    結(jié)核病中肺結(jié)核最為常見(jiàn),而其中有近一半為支氣管結(jié)核[15-16]。支氣管結(jié)核由結(jié)核桿菌感染引起,感染途徑分為肺結(jié)核病灶中直接植入支氣管黏膜和通過(guò)支氣管周邊組織直接侵及[17-19]。支氣管結(jié)核病治療周期長(zhǎng),傳統(tǒng)給藥方式下患者治療依從性較差,使得病菌產(chǎn)生耐藥性,加大治療難度[20-22]。采用原位凝膠進(jìn)行治療,可使藥物緩慢釋放,無(wú)需頻繁給藥,提高治療效果。本研究通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法,以P407和P188為影響因素,膠凝溫度為因變量,對(duì)異煙肼溫敏型原位凝膠處方進(jìn)行了優(yōu)化,彌補(bǔ)了原有凝膠制備方法中膠凝溫度高、毒性大的缺點(diǎn)。相比異煙肼水溶液,優(yōu)化處方后制備的異煙肼原位凝膠在小鼠體內(nèi)具有更高的藥物濃度,且清除率低,具有緩釋的效果,為臨床異煙肼治療支氣管結(jié)核提供了新思路。

    P407及P188被用來(lái)優(yōu)化原位凝膠處方,使達(dá)到最佳凝膠溫度[23]。研究表明,凝膠溫度與P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)負(fù)相關(guān),與P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)正相關(guān)[24-25],與本研究結(jié)果相似,因此調(diào)節(jié)P407和P188在凝膠處方中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可調(diào)節(jié)凝膠溫度。當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤20%時(shí),P188用量即使極低,膠凝溫度也高于人體正常體溫(37℃),而當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥30%,P407無(wú)法完全溶脹,且膠凝溫度低于室溫(25℃),需大量P188才能達(dá)到較為理想的膠凝溫度。故本研究中設(shè)定P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%~30%,P188為0~6%,避免了溶脹及用量過(guò)大等問(wèn)題。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化異煙肼溫敏型原位凝膠處方并確定最優(yōu)處方中P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.0%、P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%,發(fā)生相轉(zhuǎn)變溫度為34.2℃。該溫度高于環(huán)境溫度且低于人體溫度,為異煙肼溫敏型原位凝膠應(yīng)用提供了前提。

    注:A組使用異煙肝溫敏型原位凝膠;B組使用異煙肼水溶液

    作為治療支氣管結(jié)核藥物,異煙肼需從溫敏型原位凝膠中釋放,且在病灶部位停留較長(zhǎng)時(shí)間,即藥物需要具備一定緩釋能力。本研究考察了優(yōu)化處方后制備的異煙肼溫敏型原位凝膠體外釋放及滯留能力,結(jié)果顯示給藥后120 min,凝膠中異煙肼累積釋藥率達(dá)84.35%,釋放時(shí)間長(zhǎng)于水溶液(60 min)。異煙肼原位凝膠釋藥曲線符合Weibull方程,與張利竣等[24]研究相似,表明本研究制備的凝膠釋藥緩慢、持久,且釋藥完全。在使用時(shí)可使藥效充分發(fā)揮,減少用藥次數(shù)。小鼠活體成像結(jié)果也顯示該處方制備的異煙肼溫敏型原位凝膠安全性好,在給藥部位滯留時(shí)間長(zhǎng)。藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),采用氣管注射方式給藥,相比水溶液,溫敏型原位凝膠血藥峰濃度較大,消除較慢,藥物代謝時(shí)間長(zhǎng),對(duì)支氣管結(jié)核的治療效果也更好[25]。本研究中,凝膠組異煙肼質(zhì)量濃度是水溶液組的6.3倍,之后隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),兩組小鼠體內(nèi)異煙肼濃度逐漸降低,但其具體原因尚未完全明確,還需后續(xù)深入研究,探討其具體機(jī)制。

    綜上所述,本研究?jī)?yōu)化處方制備的溫敏型原位凝膠可提高藥物治療濃度,延長(zhǎng)藥物維持時(shí)間,減少用藥次數(shù),臨床價(jià)值較好,且能避免臨床上用藥不足、不按時(shí)及不足療程等問(wèn)題。

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