橡膠樹熱激蛋白HbHSP90.8-1基因的克隆與功能分析

劉明洋 肖化興 王立豐 梁曉宇 張 宇 王 萌*

（1. 海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，?？?571101）

熱激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）是一種高度保守和豐富的蛋白，在生物和非生物脅迫下積累，并作為多種蛋白的分子伴侶，其主要參與激酶底物空間結(jié)構(gòu)的形成、底物的激活、初始應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)和維持轉(zhuǎn)錄因子空間結(jié)構(gòu)等。例如，當(dāng)HSP90 伴侶活性較高時(shí)，生長(zhǎng)素受體蛋白TIR1 正確折疊形成功能性SCF復(fù)合體，對(duì)促使Aux/IAA 轉(zhuǎn)錄因子降解起關(guān)鍵作用。HSP90 被蛋白激酶HopBF1 磷酸化后會(huì)使ATP 酶活性和伴侶功能失活，導(dǎo)致觸發(fā)植物過(guò)敏反應(yīng)免疫受體的激活受阻止。在植物中，對(duì)病原菌最有效的特異性抗性來(lái)自抗病R 基因，R 基因大多數(shù)編碼NLR蛋白，HSP90 通過(guò)調(diào)節(jié)植物NLR 蛋白的活性來(lái)應(yīng)對(duì)病原菌的侵染。植物中如果沒有HSP90 蛋白會(huì)降低擬南芥（）RAR1 對(duì)R 基因介導(dǎo)的免疫功能，同時(shí)也會(huì)降低免疫受體MLA1和MLA6 的積累，表明HSP90 對(duì)NLR 的穩(wěn)定性和免疫受體復(fù)合體的形成至關(guān)重要。HSP90的分子伴侶SGT1 是維持Rx 和N 在內(nèi)的NLR 的穩(wěn)態(tài)水平所必需。SGT1 不僅在調(diào)節(jié)植物NLR 活性方面發(fā)揮積極作用，而且在控制NLR 蛋白如RPM1、RPS5 和SNC1 的循環(huán)方面也發(fā)揮消極作用。研究證明HSP90 與分子伴侶等底物多肽相結(jié)合來(lái)調(diào)控植物抗病性。在大麥（）中HSP90-RAR1-SGT1 相互作用提高對(duì)大麥條銹病的抗病性。在番茄（）中HSP90與SGT1相互作用提高番茄抗性基因Tm-22對(duì)TMV 的抗病功能。并且已有研究表明基因沉默還會(huì)引起泛素化蛋白積累和細(xì)胞死亡，對(duì)番茄黃化曲葉病毒有緩解作用。HSP90 除了在植物免疫應(yīng)答中發(fā)揮積極作用外，HSP90 還參與了NLR 的周轉(zhuǎn)控制，這種調(diào)控對(duì)于維持適當(dāng)水平的NLR 蛋白至關(guān)重要，以避免可能導(dǎo)致自身免疫缺陷的免疫受體的過(guò)度積累。

橡膠樹（）是熱帶地區(qū)典型的經(jīng)濟(jì)樹種，所產(chǎn)的天然橡膠在軍工、航天及醫(yī)療等具有特殊和重要的地位。橡膠樹在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中面臨許多病害侵染，造成橡膠產(chǎn)量損失，橡膠樹白粉?。ǎ┦窍鹉z樹主要葉部病害之一。白粉病主要危害橡膠樹的幼嫩組織，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病葉布滿白粉，皺縮畸形，最后脫落，從而造成膠乳產(chǎn)量降低。近年來(lái)，隨著基因在植物中的作用機(jī)制深入的研究、分子生物學(xué)等新技術(shù)的高速發(fā)展以及橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的建立，培育橡膠樹白粉病抗病品種是有效且經(jīng)濟(jì)的手段。目前，關(guān)于基因在橡膠樹中的功能還鮮有報(bào)道，揭示其在橡膠樹中的特異性功能有助于拓寬對(duì)的認(rèn)知。為解析在橡膠樹中的抗白粉病功能，本研究利用前期橡膠樹基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)PCR 技術(shù)克隆得到-基因，利用生物信息學(xué)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析；同時(shí)通過(guò)熒光定量對(duì)其在白粉菌侵染、植物抗病相關(guān)激素及HO處理中表達(dá)量分析，為深入研究-基因功能及調(diào)控橡膠樹抗白粉病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家橡膠樹種質(zhì)資源圃選取健康10年樹齡正常割膠的橡膠樹品種熱研73397 的根、花、枝、莖、葉和膠乳為材料，用于-基因的克隆和在不同組織中的表達(dá)分析。選取株高70～80 cm橡膠樹熱研73397組培苗用于白粉菌侵染、HO和不同激素等處理。

植物RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP441）購(gòu)自天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌（）DH5-感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101菌株購(gòu)自TaKaRa 公司。PCR 引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。Phanta 高保真酶、ClonEXpress Ⅱ試劑盒、第二代TOPO 克隆試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊公司。

1.2 試驗(yàn)方法

橡膠樹品種熱研73397 的根、莖、葉、花、枝和膠乳作為-基因克隆和不同組織的表達(dá)量分析。在橡膠樹品種熱研73397 組培苗上分別噴施200 μmol·L水楊酸（Salicylic Acid，SA）、200 μmol·L茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，Me-JA）、200 μmol·L脫落酸（Abscisic Acid，ABA）、1%（V/V）乙烯（Ethylene，ETH）、2%（V/V）過(guò)氧化氫（Hydrogen Peroxide，HO），對(duì)照組植株噴施0.05%（V/V）的乙醇水溶液。在噴施激素后的0、0.5、2、6、10、24 h 采集試驗(yàn)組材料，對(duì)照組同時(shí)采樣。白粉菌侵染試驗(yàn)前，對(duì)橡膠樹品種熱研73397隔離一周后再進(jìn)行白粉菌侵染試驗(yàn)，采集侵染后0、3、6、12、24、48、72、96 h 的葉片，對(duì)照組同步采樣。樣品均用液氮速凍后放入冰箱中-80 ℃保存，每樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

試驗(yàn)前使用75%乙醇清潔實(shí)驗(yàn)區(qū)和灼燒研缽、勺子等器具，并將液氮分裝于保溫壺中備用。采集的所有樣品參考天根生化科技有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行提取，采用Thermo Fisher NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA 濃度和純度，提取后的RNA 于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆?。RNA 反轉(zhuǎn)錄方法按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟，以橡膠樹內(nèi)參基因HbActin-F/R 為引物檢測(cè)cDNA 質(zhì)量，并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性及cDNA的濃度和純度。

根據(jù)橡膠樹基因組獲得-基因序列，利用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物--F，5′-AGAAGCTGCTAGAAACCG-3′，--R，5′-TTCCTGTCATACGCTGAAC-3′，引物序列由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的橡膠樹熱研73397 葉片的cDNA 為模板，按照高保真酶試劑盒說(shuō)明書，利用PCR 擴(kuò)增橡膠樹-基因的全長(zhǎng)序列，將目的條帶按膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，目的片段連接PMD-18T 載體，水浴16 ℃連接4 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR檢測(cè)后挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

利用在線分析軟件對(duì)-進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析（見表1）。利用DNAMAN 工具軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。MEGAX 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（neighbor-joining，bootstrap 值設(shè)為1 000）。用于系統(tǒng)進(jìn)化分析的蛋白序列從PlantTFDB、NCBI下載。

表1 生物信息學(xué)在線分析工具Table 1 Bioinformatics online analysis tool

根據(jù)-基因序列ORF 區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒 光 定 量 引 物--QF，5′-GGGCCTAAAACTTGGGAAAG-3′；--QR，5′-GACGTCACAACCACACAAGG-3′以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，橡膠樹（GenBank：HQ260674.1）基因?yàn)閮?nèi)參，熒光定量引物-F，5′-GATGTGGATATCAGGAAGGA-3′；-R，5′-CATACTGCTTGGAGCAAGA-3′；熒光定量采用SYBR Green 法進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)分析-基因在白粉菌侵染、植物抗病相關(guān)激素、HO及不同組織處理的表達(dá)模式。

基因表達(dá)量為3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。基因相對(duì)表達(dá)結(jié)果在Excel 2016 軟 件 中 用2法進(jìn) 行 分 析。使 用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA 檢驗(yàn)分析差異顯著性，使用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbHSP90.8-1基因的克隆

以橡膠樹熱研73397 健康樹葉片的cDNA 為模板，采用PCR 擴(kuò)增-，結(jié)果如圖1 所示，擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的特異性條帶。測(cè)序驗(yàn)證后，將cDNA序列命名為-（Gen-Bank：MW413357）。-基因的cDNA 全長(zhǎng)序列2 844 bp，包含2 454 bp 的開放閱讀框（ORF），編碼817個(gè)氨基酸。

圖1 HbHSP90.8-1基因擴(kuò)增結(jié)果M.DL5000 DNA Marker；1.目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The PCR amplification products of HbHSP90.8-1M.DL5000 DNA Marker；1.The objective gene amplification products

2.2 HbHSP90.8-1基因生物信息學(xué)分析

利用ProtParam 工具在線分析HbHSP90.8-1氨基酸編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：分子式CHNOS，總原子數(shù)13 118，分子質(zhì)量為93 526.92 Da，等電點(diǎn)4.88，總平均親水性為-0.757，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）為121，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為163，不穩(wěn)定系數(shù)為34.33（該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)是76.38，推測(cè)HbHSP90.8-1 蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的親水蛋白。采用TMHMM Server v.2.0 在線工具分析預(yù)測(cè)表明HbHSP90.8-1蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。NCBI保守結(jié)構(gòu)域工具分析預(yù)測(cè)表明HbHSP90.8-1 蛋白存在HATPase-Hsp90-like 和HSP90 superfamily 結(jié)構(gòu)域，其位置分別位于87～277 和259～780 aa 處（見圖2A）。利用SOPMA 分析HbHSP90.8-1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示螺旋占50.67%，延長(zhǎng)鏈占12.73%，β 折疊占4.65%，無(wú)規(guī)卷曲占31.95%（見圖2B）。利用SWISS-MODEL 分析HbHSP90.8-1 的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2C 所示。利用DNAMAN 軟件對(duì)來(lái)源于不同植物的HSP90 相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)（見圖3A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)橡膠樹HbHSP90.8-1 與木薯（，XP_021601014.1）、麻風(fēng)樹（，KDP36908.1）、蓖麻（，XP_002510550.1）等不同物種的HSP90 蛋白均具有較高的同源性。多序列比對(duì)分析并根據(jù)圖2A 分析的結(jié)果標(biāo)注HbHSP90.8-1 保守結(jié)構(gòu)域（見圖3A）。采用MEME 工具分析橡膠樹HbHSP90.8-1與其在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)親緣性較高的HSP90 蛋白序列，預(yù)測(cè)了排名前三的motif（見圖3B）。為了分析橡膠樹HbHSP90.8-1 與其他植物HSP90 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明橡膠樹HbHSP90.8-1與木薯MeHSP90 的親緣關(guān)系最近，在分類上與麻風(fēng)樹JcHSP90 聚為一類，這預(yù)示著他們的功能可能具有相似性（見圖4A）。SignalP-5.0 Server 分析預(yù)測(cè)HbHSP90.8-1 存在信號(hào)肽的概率為98.5%。DeepLoc1.0 預(yù)測(cè)分析HbHSP90.8-1蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上（見圖4B）。綜上，HbHSP90.8-1可編碼一個(gè)分泌型且無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白。

圖2 HbHSP90.8-1結(jié)構(gòu)分析A.保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；B.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C.三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Structural analysis of HbHSP90.8-1A.Prediction of the conserved domains；B.Prediction for the secondary structure；C.Prediction for the tertiary structure

圖3 HbHSP90.8-1與其他植物HSP90蛋白序列A.HbHSP90.8-1與其他植物HSP90蛋白序列多重對(duì)比；B.HbHSP90.8-1與其他植物HSP90蛋白序列MEME聚類Fig.3 Protein sequence analysis of HbHSP90.8-1 with other plant HSP90 proteinsA.Multiple protein sequence alignment of HbHSP90.8-1 with other plant HSP90 proteins；B.MEME cluster analysis of HbHSP90.8-1 with other plant HSP90 proteins.

圖4 HbHSP90.8-1的聚類分析和亞細(xì)胞定位分析A.橡膠樹HbHSP90.8-1 蛋白與其他物種HSP90 蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（大豆GmHSP90（Glycine max，XP_003545030.1）；相思豆ApHSP90（Abrus precatorius，XP_027368246.1）；銀白楊PaHSP90（Populus alba，XP_034931576.1）；紅脈麥果RrHSP90（Rhamnella rubrinervis，KAF3446793.1）；葡萄VvHSP90（Vitis vinifera，XP_002273785.1）；紫花風(fēng)鈴木HiHSP90（Handroanthus impetiginosus，PIN15193.1）；擬南芥AtHSP90（Arabidopsis thaliana，NP_194150.1）；漾 濞 槭AyHSP90（Acer yangbiense，TXG52042.1）；小 墊 柳SbHSP90（Salix brachista，KAB5557693.1）；胡楊PeHSP90（Populus euphratica，XP_011045067.1）；毛果楊PtHSP90（Populus trichocarpa，XP_002307732.1）；蓖麻RcHSP90（Ricinus communis，XP_002510550.1）；木 薯MeHSP90（Manihot esculenta，XP_021601014.1）；麻 風(fēng) 樹JcHSP90（Jatropha curcas，KDP36908.1），橡膠樹HbHSP90.8-1）；B.HbHSP90.8-1亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Fig.4 Phylogenetic tree analysis and subcellular localization prediction of HbHSP90.8-1A.Phylogenetic tree analysis of HbHSP90.8-1 protein with other species HSP90 proteins；GmHSP90（Glycine max，XP_003545030.1）；ApHSP90（Abrus precatorius，XP_027368246.1）；PaHSP90（Populus alba，XP_034931576.1）；RrHSP90（Rhamnella rubrinervis，KAF3446793.1）；VvHSP90（Vitis vinifera，XP_002273785.1）；HiHSP90（Handroanthus impetiginosus，PIN15193.1）；AtHSP90（Arabidopsis thaliana，NP_194150.1）；AyHSP90（Acer yangbiense，TXG52042.1）；SbHSP90（Salix brachista，KAB5557693.1）；PeHSP90（Populus euphratica，XP_011045067.1）；PtHSP90（Populus trichocarpa，XP_002307732.1）；RcHSP90（Ricinus communis，XP_002510550.1）；MeHSP90（Manihot esculenta，XP_021601014.1）；JcHSP90（Jatropha curcas，KDP36908.1）；HbHSP90.8-1B.Prediction of HbHSP90.8-1 subcellular localization

2.3 HbHSP90.8-1表達(dá)模式分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，-在橡膠樹不同組織中的表達(dá)量差異顯著（見圖5A）。-在橡膠樹的根、花、枝、莖、葉膠、乳中均有表達(dá)，其中在膠乳中的表達(dá)量較高，枝次之，在根、莖、葉的表達(dá)量較低，膠乳的表達(dá)量是根、花、葉的28倍左右，表明-基因主要作用在膠乳中。白粉菌侵染橡膠樹葉片后，-基因的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在6 h表達(dá)量達(dá)到最高，是處理前的4倍，表明白粉菌侵染會(huì)導(dǎo)致-基因表達(dá)量顯著性上升（見圖5B）。在HO處理下，橡膠樹-基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，在處理后的10 h 表達(dá)量達(dá)到處理前的4.5 倍，表明-基因受HO的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（見圖5C）。在ABA和ETH激素處理下，-基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升的表達(dá)趨勢(shì)，分別在2、10 h表達(dá)量達(dá)到最高，分別是處理前的26、21倍，表明-基因受ABA 和ETH激素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)（見圖6：A、B）。在MeJA和SA激素噴施處理后，-基因在橡膠樹中的表達(dá)量如圖所示（見圖6：C、D）。-基因的表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，-基因在MeJA處理和SA處理的2 h表達(dá)量達(dá)到最低，分別是處理前的8.5、14.0倍，表明JA和SA激素的處理會(huì)導(dǎo)致-基因表達(dá)量的顯著下降。

圖5 HbHSP90.8-1 基因在組織、白粉菌侵染和H2O2處理葉片表達(dá)模式A.組織；B.白粉菌侵染處理；C.H2O2處理Fig.5 Expression pattern of HbHSP90.8-1 gene in tissue，drought，powdery mildew infection，H2O2，mechanical wounding treatmentA.Tissue；B.Oidium heveae infection；C.H2O2 treatment

圖6 HbHSP90.8-1基因在不同激素處理的表達(dá)模式A.ABA激素處理；B.ETH激素處理；C.MeJA激素處理；D.SA激素處理Fig.6 Expression pattern of HbHSP90.8-1 gene in different hormone treatmentsA.ABAtreatment；B.ETHtreatment；C.MeJAtreatment；D.SAtreatment

3 討論

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到各種逆境脅迫的影響，包括高溫、高鹽和病原菌侵染等脅迫。熱激蛋白HSP90 在植物抗病過(guò)程及穩(wěn)定和激活各種關(guān)鍵信號(hào)蛋白方面發(fā)揮重要作用。為了解-基因在橡膠樹中的抗白粉病功能，本研究從橡膠樹品種熱研73397 的葉片克隆了-基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HbHSP90.8-1存在HATPase-Hsp90-like和HSP90 superfamily結(jié)構(gòu)域。ATP結(jié)構(gòu)域是ATP/ADP 結(jié)合位點(diǎn)，具有內(nèi)源ATP 活性。ATP 存在情況下會(huì)參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和多肽折疊等。且有研究表明HSP90的ATPase 結(jié)構(gòu)域與RAR1 的CORDI 域結(jié)合，同時(shí)與SGT1 蛋白的CS 域特異結(jié)合，對(duì)于擬南芥RPS2介導(dǎo)的抗病性起核心作用。推測(cè)-基因參與橡膠樹抗病響應(yīng)過(guò)程。HbHSP90.8-1 定位預(yù)測(cè)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是一個(gè)有信號(hào)肽、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定親水蛋白。在楊樹基因家族成員通過(guò)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明-和-分別定位在葉綠體和線粒體上，-定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在應(yīng)激情況下，HSP90s 會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核和核仁發(fā)揮作用。推測(cè)-在參與橡膠樹抗白粉病時(shí)可能會(huì)遷移到細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

本研究通過(guò)qRT-PCR 分析-表達(dá)模式，結(jié)果表明-在橡膠樹根、花、枝、莖、葉、膠乳中均有表達(dá)，但主要在橡膠樹的膠乳中表達(dá)。番茄和辣椒中的在絕大多數(shù)組織中也都有表達(dá)。表明-與大部分基因的表達(dá)特性一致。R 基因編碼的NBLRR 蛋白參與感知病原體產(chǎn)物和調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)和死亡。MLA 屬于NB-LRR 蛋白之一，參與植物的抗病過(guò)程。大麥中MLA基因?qū)Π追鄄〉目剐允峭ㄟ^(guò)識(shí)別SGT1-Rar1 復(fù)合體在通路的下游對(duì)白粉病起抗病作用。研究表明基因通過(guò)VIGS方法沉默后發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)的大麥白粉菌抗性減弱，證明了基因通過(guò)調(diào)控基因參與對(duì)白粉病的抗性過(guò)程。HSP90的分子伴侶SGT1也參與橡膠樹白粉病的抗病性。在橡膠樹葉片上接種白粉菌后，通過(guò)觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)突變體表現(xiàn)出稀疏的菌絲網(wǎng)絡(luò)，并且突變體上活性氧的產(chǎn)生也降低了，表明參與橡膠樹白粉病的抗病反應(yīng)。推測(cè)HSP90 與分子伴侶SGT1 相互作用，從而啟動(dòng)一個(gè)特異性信號(hào)級(jí)來(lái)參與抗病反應(yīng)過(guò)程。在本研究中接種白粉菌后發(fā)現(xiàn)，-基因的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在6 h表達(dá)量達(dá)到最高，是處理前的4倍，表明白粉菌侵染會(huì)導(dǎo)致-基因表達(dá)量顯著性上升。與的 研 究 結(jié) 果 一 致。推 測(cè)-基因可能參與橡膠樹白粉菌抗性過(guò)程。SA、JA、ETH、ABA 等多種植物激素調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互作用對(duì)植物抗病能力有重要影響。已有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SA、MeJA 和ETH 處理顯著上調(diào)了南瓜抗白粉病自交系中的表達(dá)，表明響應(yīng)植物激素信號(hào)途徑。在南瓜中采用qRTPCR 分析顯示基因?qū)A 處理具有明顯應(yīng)答反應(yīng)，說(shuō)明基因也響應(yīng)SA 激素處理。ETH 與ABA 在EIN3-AB14-VTC2 級(jí)聯(lián)蛋白在抗壞血酸AsA（ascorbic acid）生物光合過(guò)程調(diào)控活性氧ROS（reactive oxygen species）積累以應(yīng)對(duì)病原菌對(duì)植物的侵染。ABA 和ETH 處理后發(fā)現(xiàn)，-基因表達(dá)量顯著上調(diào)表達(dá)，分別是處理前的26、21 倍，在MeJA 和SA 處理后發(fā)現(xiàn)，-基因的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下調(diào)的趨勢(shì)，在2 h 表達(dá)量達(dá)到最低，分別是處理前的8.5、14 倍，表明-響應(yīng)ABA、ETH、JA 和SA 信號(hào)途徑，推測(cè)ABA、ETH、JA 和SA 作為信號(hào)分子參與-抗病防御反應(yīng)過(guò)程中。植物在受到病原菌感染后，會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，感染部位會(huì)有大量活性氧ROS產(chǎn)生和積累。白粉菌侵染會(huì)造成葉片組織結(jié)構(gòu)損傷，使植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)來(lái)應(yīng)對(duì)白粉病原菌。在HO處理下，發(fā)現(xiàn)橡膠樹-基因上調(diào)表達(dá)，推測(cè)-基因參與植物體內(nèi)HO誘導(dǎo)抗病傳導(dǎo)過(guò)程。綜上所述，初步認(rèn)為-基因不僅響應(yīng)白粉菌侵染脅迫的應(yīng)答，還受植物抗病相關(guān)激素和HO誘導(dǎo)，推測(cè)-在橡膠樹白粉病抗病傳導(dǎo)過(guò)程及激活植物免疫過(guò)程中有重要作用。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步了解橡膠樹-基因的功能以及橡膠樹抗白粉病分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。