rpl32-trnL片段在柳穿魚不同地理居群遺傳多樣性分析中的應用

張玉潔 石鵬霞 趙 凡 陳曉丹 孫 坤 張 輝

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎和核心，一個物種的穩(wěn)定性和進化潛力依賴其遺傳多樣性，而不同物種的經(jīng)濟和生態(tài)價值也依賴其特有的基因組成，因此保護物種遺傳多樣性具有重要意義。葉綠體DNA（cpDNA）依賴單親遺傳，具有分子量小、拷貝數(shù)多及結構簡單等特點，常用于遺傳多樣性分析。cpDNA 非編碼區(qū)相較于編碼區(qū)在堿基插入/缺失（InDel）及替換等突變上都表現(xiàn)出了更快的進化速率，經(jīng)常用于比較低級分類階元和新近分化類群的研究。孫坤等對柳穿魚（）cpDNA 的非編碼片段32-L、Q-5’16、T-L 和S-G 進行研究，發(fā)現(xiàn)32-L 片段蘊含豐富的變異位點，且在柳穿魚居群間分化明顯，可作為進一步研究柳穿魚群體遺傳學的理想分子標記。

柳穿魚是玄參科（Scrophulariaceae）柳穿魚屬（）多年生草本植物，廣泛分布于我國北方地區(qū)，生于沙質地、草原、干山坡和山溝路旁等處；具有自交不親和特性，為蟲媒異交。柳穿魚不僅用作園林花卉，還是一種常見蒙藥，地上部分入藥，有清熱解毒、散瘀消腫之效；此外，柳穿魚中提取的黃酮類化合物對高脂血癥和肝臟脂肪變性具有保護作用，可抑制多種腫瘤細胞生長，柳穿魚酸及其衍生物具有顯著的預防過敏活性。目前，國內外關于柳穿魚的研究主要集中在其栽培技術、生理生態(tài)以及活性成分等方面，但其居群遺傳多樣性的研究鮮見報道。Gabriel 等利用等位酶研究了柳穿魚屬5個自交不親和種與3個自交親和種的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)自交不親和種相對于自交親和種保持了更高的居群遺傳多樣性，居群間遺傳多樣性和居群分化程度更低；陳曉丹利用RAPD 對中國柳穿魚自然居群遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)柳穿魚自然居群內存在較高的遺傳多樣性，居群間存在頻繁的基因交流和多次融合事件。

鑒于此，本研究利用cpDNA 的32-L 序列對柳穿魚4個地理居群的遺傳多樣性指數(shù)、單倍型網(wǎng)絡關系、遺傳分化及基因流水平等方面進行深入分析，探討柳穿魚繁殖策略及地理隔離等因素對其居群遺傳多樣性影響，為柳穿魚種質資源的合理開發(fā)利用及多樣性保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

試驗材料分別采自河北龍頭山查字林場、河北圍場、寧夏銀川及甘肅合水，每個自然居群選取13～17 個個體，個體間距超過3 m，共采集樣本62株（以單株采集），將樣本放入裝有變色硅膠的自封袋干燥保存。本研究采集的柳穿魚野生居群分布信息詳見表1。

表1 柳穿魚野生居群采樣分布數(shù)據(jù)Table 1 Distribution data of wild population of L.vulgaris

1.2 試驗方法

采用改良的CTAB 法提取柳穿魚基因組DNA，將 提 取出的DNA 溶于1×TE 緩沖液置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩CR擴增cpDNA的32-L片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，通用引物F（5′-CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT-3′）和R（5′-CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC-3′）。PCR 反應總體系為25.00 μL，其中無菌雙蒸水12.50 μL、10×buffer 2.50 μL、MgCl3.00 μL、dNTP 3.00 μL、酶（5 U）0.75 μL、上 下 游 引 物 各1.00 μL 及DNA 模 板1.25 μL。PCR 反 應 程 序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB分離染色，并用Bio-Rad圖形分析儀進行觀察和記錄，產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行直接雙向測序。

測序結果用Chromas 2.6.6 軟件讀取序列，人工校對去除兩端峰圖信號雜亂的低質量堿基。使用DNAstar 7.0 軟件中的Megalian 程序進行序列比對，以獲得最終序列比對結果。柳穿魚4個地理居群遺傳多樣性高低利用DnaSP 6.12軟件統(tǒng)計可變位點（variable sites）、簡約信息位點（parsimony informative sites）和插入-缺失位點（InDel）、單倍型多樣性（）、核苷酸多樣性（）和核苷酸平均多樣性（）等參數(shù)進行描述；計算Tajima’s和Fu and Li’s值檢驗居群進化過程是否符合中性進化理論。柳穿魚各居群單倍型使用MEGA 7.0基于最大似然法（Maximum likelihood，ML）構建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用NETWORK 5.0基于Median-joining 法對所有個體構建單倍型網(wǎng)絡關系。進一步用GenAIEx 6.503檢驗各居群間遺傳分化與地理距離的相關 性，ARLEQUIN 3.5進行 分子變異 分 析（analysis of molecular variance，AMOVA），探究地理因素對柳穿魚4個地理居群的遺傳多樣性的影響。

2 結果與分析

2.1 柳穿魚rpl32-trnL序列差異及多態(tài)性2.1.1 序列變異分析

柳穿魚32-L 片段序列長度為857 bp，4個地理居群的62 個個體共檢測到保守位點751個、變異位點76 個，其中插入-缺失位點55 個，單一變異位點（singleton variable sites）11 個，分別為23、68、70、73、74、75、370、378、411、509 和684 堿基位點；簡約信息位點10 個，分別是125、142、254、329、537、548、606、626、646和667堿基位點。

通過對柳穿魚4 個居群、62 個個體的分析，共獲得15 種單倍型，其中只有CZ 和WC 共享兩個單倍型，分別是Hap_2 和Hap_7。單倍型Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6 和Hap_8 為CZ 居群特有，Hap_13為WC特有，Hap_1、Hap_14和Hap_15為YC特有，Hap_9、Hap_10、Hap_11和Hap_12為HS特有。YC居群的優(yōu)勢單倍型為Hap_14，HS居群的優(yōu)勢單倍型為Hap_10，WC 居群的優(yōu)勢單倍型是Hap_13，CZ居群單倍型最豐富，但沒有明顯的優(yōu)勢單倍型（見圖1），不同居群各單倍型具體分布數(shù)量見表2。

表2 柳穿魚4個不同地理居群的單倍型分布、遺傳多樣性及中性檢驗Table 2 Haplotypes distribution，genetic diversity and neutrality test from four geographic populations of L.vulgaris

圖1 柳穿魚4個居群的單倍型地理分布Fig.1 Haplotype geographical distribution from four populations of L.vulgaris

柳穿魚4個地理居群、62個個體的總單倍型多樣性（）為0.878，核苷酸多樣性（）為0.003 88，核苷酸平均多樣性（）為2.994（表2）。其中，CZ居群、和最高，分別為0.838、0.003 37 和2.603。柳穿魚4 個地理居群分布于我國西北（XB）和華北兩地（HB），其中西北居群總遺傳多樣性水平更高，分別是0.872（）、0.003 47（）和2.808（）；4個居群Tajima’s檢驗均為負值，但均不顯著（＞0.05），表明柳穿魚居群的進化基本符合中性進化理論；Fu and Li’s檢驗中只有HS 顯著性檢驗結果顯著；XB 和HB 的Tajima’s和Fu and Li’s檢驗均為負值，同樣也不顯著（＞0.05）（見表2）。

2.2 柳穿魚單倍型網(wǎng)絡關系

以柳穿魚屬物種的紫花個體序列Lb/Purple 和黃花個體序列Lb/Yellow 作為外類群，采用Maximum Likelihood 方法構建柳穿魚的單倍型系統(tǒng)進化樹，結果顯示西北居群和華北居群單倍型各自聚為一支（見圖2）。其中，西北YC 和HS居群的單倍型分別聚在一起，HS居群單倍型相比于YC居群更為古老；華北CZ和WC居群單倍型交叉在一起，沒有明顯的居群特征（見圖2）。同時，基于Median-joining 法對柳穿魚的15 種單倍型構建了網(wǎng)絡關系，發(fā)現(xiàn)15 種單倍型間的突變聯(lián)系在1～5 個突變之間，Hap_10 和Hap_13 之間存在1個突變，其與Hap_14之間存在3個突變；CZ 和WC居群的單倍型間聯(lián)系較緊密，YC 居群的3 個單倍型較其他居群分化明顯；HS 居群的其余3 個單倍型均與Hap_10 產(chǎn)生突變聯(lián)系，其中Hap_11 差異最大（見圖3）。

圖2 基于最大似然法（ML）構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of haplotypes based on Maximum likelihood

圖3 基于Median-joining法構建的單倍型網(wǎng)絡YC.○；HS.●；CZ.；WC.；+代表一個突變聯(lián)系Fig.3 Haplotype network relationships constructed by Median-joining methodYC.○；HS.●；CZ.；WC.；+stands for a mutation

2.3 柳穿魚不同地理居群間的遺傳分化和基因流

遺傳分化指數(shù)（）在一定程度上反映了不同居群間遺傳關系的遠近；取值0～1，其大于0.25時表明居群間遺傳分化很大，而基因流（）的基本作用是削弱居群間的遺傳分化。柳穿魚4個地理居群總遺傳分化為0.654，基因流為0.13；XB 和HB 居群間遺傳分化為0.466，基因流為0.29（見表3）。各居群間遺傳分化在0.067～0.842，基因流在0.05～3.46（見表3）。其中，CZ 和WC 間的基因流最大，遺傳分化最小，兩居群基因交流頻繁。在地理距離上YC 與HS 間的地理距離要遠小于CZ、WC和HS，但YC與HS間的遺傳分化要大于CZ、WC 和HS，而基因流更小。應用Mantel分析檢驗各居群遺傳分化程度與地理距離的相關性（見圖4）結果表明，各地理居群的遺傳分化（）與地理距離之間存在中等程度相關性但不顯著（=0.36，＞0.05）。

圖4 柳穿魚各居群地理距離與遺傳分化之間的Mantel相關性Fig.4 Mantel correlation analysis between geographic distance and genetic differentiation in different populations of L.vulgaris

表3 柳穿魚四個不同地理居群之間的遺傳分化和基因流Table 3 Genetic differentiation and gene flow among fourgeographic populations of L.vulgaris

2.4 柳穿魚不同地理居群的分子變異分析（AMOVA）

柳穿魚不同地理居群遺傳變異的分子變異分析（AMOVA）結果見表4。不同地理居群間的遺傳變異大（=0.654），發(fā)生在西北和華北居群間的遺傳變異僅占3.15%，而發(fā)生在組內居群間的遺傳變異占45.37%，各居群內的遺傳變異占51.49%，說明柳穿魚各地理居群的遺傳變異主要來自于居群內部。

表4 柳穿魚不同地理居群遺傳變異的AMOVA分析Table 4 AMOVA analysis of genetic variation in different geographical populations of L.vulgaris

3 討論

3.1 柳穿魚居群遺傳多樣性

從4 個葉綠體序列中篩選出的32-L 片段蘊含豐富的信息位點，可用于分析柳穿魚自然居群的遺傳多樣性，以期為柳穿魚的資源開發(fā)利用和多樣性保護奠定基礎。本研究32-L 片段共檢測到76 個變異位點，其中插入缺失位點占總變異的72.37%，表明插入缺失是柳穿魚變異位點出現(xiàn)的主要來源。柳穿魚4 個地理居群共獲得15種單倍型，數(shù)據(jù)分析表現(xiàn)出較高的總遺傳多樣性（=0.878，=0.003 88，=2.994），這與陳曉丹利用RAPD 對柳穿魚遺傳多樣性研究的結果一致。柳穿魚居群單倍型多樣性為0.878，高于天目地黃（，=0.678）、裂葉地黃（，=0.807）和 湖 北 地 黃（，=0.569）等玄參科植物。植物的遺傳多樣性受多種因素影響，其中繁育系統(tǒng)直接影響種內遺傳變異量，是決定居群遺傳多樣性的最主要因素。Mateu-Andrés等和Torres 等利用等位酶研究了部分金魚草屬（）植物的遺傳多樣性，通過分析發(fā)現(xiàn)不同繁育系統(tǒng)的物種總遺傳多樣性（本研究我們以單倍型多樣性、核苷酸多樣性來描述物種的遺傳多樣性）表現(xiàn)為自交不親和種（0.239）＞部分自交親和種（0.175）＞自交親和種（0.050），柳穿魚屬植物表現(xiàn)出同樣的趨勢（見表5）。除了等位酶，同工酶和RAPD 也是植物遺傳多樣性研究中常用的分子標記，這兩種分子標記在柳穿魚屬及其近緣金魚草屬的遺傳多樣性分析中顯示出與等位酶一致的研究結果（見表5）。自交親和物種依賴近交，居群間基因流動較小使得各居群間存在較大的遺傳變異；自交不親和物種繁殖依賴異交，各居群間基因交流頻繁，后代中有相當比例的雜合體使居群內保持高的遺傳變異，因此其遺傳多樣性維持在較高水平。此外，Brown 和Hamrick 等認為廣布、異交以及動物傳播種子均會使物種具有較高的遺傳多樣性，故推測本研究柳穿魚具有高遺傳多樣性的原因可能是以下幾方面導致的。首先，柳穿魚為玄參科柳穿魚屬植物，在我國北方地區(qū)分布廣泛，生境類型多樣，是居群遺傳變異豐富的原因之一；其次，柳穿魚嚴格自交不親和，異交主要以鞘翅目（Coleoptera）的象鼻蟲（）作為其傳粉者，異交的交配系統(tǒng)以及動物傳粉的方式均使得柳穿魚居群出現(xiàn)高遺傳多樣性。

表5 柳穿魚屬及金魚草屬部分物種遺傳多樣性與其繁育系統(tǒng)的關系比較Table 5 The relationship between genetic diversity and breeding system of some species from Linaria and Antirrhinum

3.2 柳穿魚居群遺傳結構

AMOVA 分子變異結果表明，柳穿魚居群內的遺傳變異占51.49%，組內居群間的遺傳變異占45.37%，揭示了居群內的遺傳變異是柳穿魚遺傳變異的主要來源。推測其原因一是柳穿魚專性異交，符合自交不親和物種遺傳變異分布規(guī)律，其遺傳變異主要存在于居群內部；二是華北CZ 和WC 居群間地理距離近（30.35 km），加之蟲媒傳粉的繁殖方式，兩居群間存在頻繁的基因交流（=3.46），因此組內居群間的遺傳變異相對較高。繁殖方式與遺傳變異分布之間的密切聯(lián)系，在其近緣金魚草屬多個自交不親和物種的遺傳變異分布特征中也得到印證。

植物居群的遺傳結構受遺傳分化和基因流的影響，遺傳分化指數(shù)（）可用來反映群體進化歷史，其大小可在一定程度上揭示居群間基因流和遺傳漂變的程度。地理隔離是植物居群間基因交流的天然屏障。本研究柳穿魚自然居群間的遺傳分化為0.654 47，表明居群間存在大的遺傳分化；4 個地理居群分布于我國西北和華北，兩地居群間遺傳分化系數(shù)為0.466 14。物種的遺傳分化程度會隨地理距離的增加而增加，地理隔離阻礙了花粉和種子傳播，各居群間基因交流受到影響，從而在長期進化過程中加劇了居群間的遺傳分化。Jiménez 等采用RAPD 揭示出金魚草屬（）的4 個居群隨地理距離增加遺傳分化程度在0.642 31～0.910 61。本研究柳穿魚兩兩居群間遺傳分化程度在0.067 41～0.841 85，基本表現(xiàn)為隨地理距離增加而增加。但在地理距離與遺傳分化的相關性上，不同物種的研究結果并不一致。Mateu-Andrés 等對金魚草屬7個物種共49個居群的Mantel相關性分析顯示出各物種內居群間的遺傳分化程度與地理距離相關性程度不一致（=0.004～0.760）但均不顯著。在本研究中，Mantel檢驗顯示柳穿魚4個居群的遺傳分化與地理距離存在中等程度相關性但相關性不顯著（=0.36，=0.09），可能是HS 和YC 居群間大的遺傳分化造成的。HS與YC居群間遺傳分化高于HS和CZ、WC 居群間的遺傳分化，推測是由于地理隔離導致居群間無法進行基因交流，且在長期進化過程中YC 居群受遺傳漂變影響而HS 居群經(jīng)歷過居群瓶頸，使兩居群間出現(xiàn)了大的遺傳分化。

3.3 柳穿魚的居群動態(tài)

柳穿魚4 個居群的基因流分析結果顯示除CZ和WC居群間存在頻繁的基因交流外，其余居群間基因交流水平均較低。中性檢驗結果表明4 個居群Tajima’均不顯著（＞0.05）；Fu and Li’s檢驗CZ、WC 和YC 居群均不顯著，但HS 居群為顯著的負值（-2.450 49，＜0.05），表明除HS 居群外的其他居群進化過程符合中性進化理論。中性檢驗顯示HS 居群近期可能經(jīng)歷過瓶頸后的擴張，單倍型網(wǎng)絡關系和系統(tǒng)發(fā)育樹結果也支持這一假設，HS居群單倍型呈星狀散射分布，其中單倍型Hap_9較為古老但優(yōu)勢單倍型為較近期的Hap_10，推測這與HS 居群生長環(huán)境相關。該居群分布在公園路旁，極易受到人為干擾引起的瓶頸事件，偶然因素的出現(xiàn)可能會使居群個體數(shù)量急劇減少，隨著生態(tài)恢復居群大小也恢復到原來的水平，但在經(jīng)歷瓶頸期間，使得居群某些稀有基因以高頻率存在，改變居群的遺傳結構和多樣性水平，一般會導致居群遺傳多樣性降低。居群越小，由于遺傳漂變的影響，稀有等位基因越容易丟失，從而降低居群遺傳多樣性，這種影響在自交不親和物種中更為明顯。

綜上，柳穿魚的繁殖策略、地理隔離以及生境干擾等因素塑造了分布于我國北方地區(qū)中國柳穿魚居群遺傳多樣性和遺傳結構特征。本研究揭示出柳穿魚繁育系統(tǒng)使得居群內具有較高的遺傳多樣性，在柳穿魚資源保護方面應在居群內盡可能增加樣本大小而不同居群應保持較遠的距離。