電針對APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬SIRT1、FOXO3A蛋白表達的影響

劉奕志 王鑫 孫潤權(quán) 劉思遠 王帥 李志剛

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，其起病隱蔽、呈進行性惡化、與年齡相關(guān)，臨床癥狀以近事記憶障礙、學(xué)習(xí)認知能力減退等為主要表現(xiàn)，又稱老年性癡呆。AD以其具有一定的家族遺傳性而明顯區(qū)別于其他類型的癡呆。隨著人口老齡化程度的加深，有研究預(yù)測2050年我國老年人口(>60歲)將達4.5億人，AD患者將超過3000萬[1]。AD的治療機制尚未完全闡明，探索其治療機制及治療方法仍具重大意義。哺乳動物Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶家族中的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)可通過去乙?；瘷C體內(nèi)的組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等，參與生物體內(nèi)神經(jīng)保護、炎性反應(yīng)、線粒體自噬等過程的調(diào)節(jié)[2]。有研究指出SIRT1基因敲除小鼠出現(xiàn)認知缺陷，而過表達SIRT1的小鼠則學(xué)習(xí)記憶能力正常[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3A(forkhead box transcription factor O3A，F(xiàn)OXO3A)是SIRT1下游的主要靶點，參與調(diào)控氧化應(yīng)激、細胞自噬等過程[4-5]，在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)細胞存活方面具有潛在的保護作用。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)“通督啟神”法電針可明顯降低AD小鼠海馬區(qū)炎性指標白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、環(huán)氧化酶-2( cyclooxygenase-2,COX-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，改善AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[6-7]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上以6月齡淀粉樣前體蛋白/早老蛋白1(amyloid precursor protein/presenilin-1，APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動物模型，通過定位與定量檢測SIRT1、FOXO3A蛋白在小鼠海馬中的表達，探討電針干預(yù)治療AD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級雄性，6月齡，APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，6月齡同源同性別的C57BL/6野生鼠10只，體質(zhì)量(28±2)g。動物均購于江蘇金致和生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(京)992014-0004。于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實驗動物中心屏障系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)。室溫維持在(24±2)°C，濕度保持在40%～60%。

1.2 主要試劑

SIRT1抗體(兔多克隆抗體，Proteintech，批號：13161-1-AP)、FOXO3A抗體(兔多克隆抗體，Proteintech，批號：10849-1-AP)、HRP標記的羊抗兔IgG(Solarbio，批號：SE134)；抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(Sigma，批號：M9281)；蘇木素伊紅染色試劑盒(碧云天，批號：C0105S)、核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(碧云天，批號：P0028)。

1.3 主要儀器

一次性無菌針灸針(0.25 mm×13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；SDZ-V型華佗牌電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；XR-XM101型Morris水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；KF-PRO-120型數(shù)字病理切片掃描儀(寧波江豐生物)；Powerpac HQ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國Bio-Rad 公司)；W20M-2型恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)。

1.4 分組與干預(yù)方法

30只APP/PS1小鼠隨機分為模型組、電針組和電針+抑制劑組，每組10只。C57BL/6野生鼠10只為空白對照組?？瞻讓φ战M與模型組在電針組接受電針干預(yù)時被自制鼠套束縛，不做其他處理。電針組選取“百會穴”“印堂穴”“水溝穴”。主穴“百會”“印堂”均朝上平刺以防電針短路，水溝穴于電針干預(yù)過程中點刺，以小鼠眼球濕潤為度。進針深度為0.5 cm，針柄連接華佗牌電針儀，頻率1 Hz，電壓2 V，電流強度0.2 mA。電針+抑制劑組在電針干預(yù)前半小時，腹腔注射3-MA溶液(30 mg/kg)，之后同電針組一樣進行電針干預(yù)。除電針+抑制劑組外，其余三組均在干預(yù)前30分鐘腹腔注射磷酸鹽緩沖溶液(30 mg/kg)，各組干預(yù)20分鐘/次，每天一次，共15天。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 Morris水迷宮實驗 在連續(xù)15天干預(yù)結(jié)束后，各組小鼠進行Morris水迷宮測試。小鼠站臺被置于第Ⅰ象限的中央并保持站臺位置不變。第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，讓小鼠熟悉水迷宮環(huán)境，若小鼠60秒內(nèi)不能自行找到站臺，則人工引導(dǎo)其找到站臺，并記錄該鼠逃避潛伏期為60秒。第2天至第5天為隱蔽平臺實驗，每天Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限各訓(xùn)練1次。本實驗選取第Ⅳ象限逃避潛伏期為觀察指標。第6天為空間探索實驗，撤除第Ⅰ象限的站臺，每象限各訓(xùn)練1次。以第四象限為入水點記錄60秒內(nèi)小鼠的站臺穿越次數(shù)及原站臺所在象限的運動距離百分比。

1.5.2 蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 完成為期6天的Morris水迷宮實驗后，第7天取材。各組小鼠稱重，行0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，待動物徹底麻醉后，各組隨機選取4只小鼠行心臟灌流術(shù)，剝離完整大腦制作石蠟標本，冠狀位切片，厚6 μm。將石蠟切片放置60 ℃烤箱1小時后，二甲苯脫蠟15分鐘兩次，梯度酒精下行各3分鐘，蘇木素8分鐘，自來水沖洗10分鐘，純水洗滌5秒，伊紅染色40秒，自來水沖洗60秒，梯度酒精上行各10秒，二甲苯各5分鐘，中性樹膠封片。待其干燥后，于顯微鏡下觀察。

1.5.3 免疫組化染色 將石蠟切片烤片脫蠟后，枸櫞酸鈉緩沖液90 ℃修復(fù)抗原20分鐘，隨后待其冷卻至室溫；PBS漂洗3次，每次5分鐘；甲醇雙氧水室溫孵育10分鐘，PBS漂洗同上；正常非免疫羊血清37 ℃孵育10分鐘，PBS漂洗同上；一抗(SIRT1抗體1∶400稀釋；FOXO3A抗體1∶800稀釋)4 ℃冰箱過夜；PBS漂洗；生物素標記二抗37 ℃孵育10分鐘，PBS漂洗；DAB顯色1分鐘。常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。待其干燥后，于顯微鏡下觀察。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測SIRT1、FOXO3A表達情況 各組余下6只小鼠在快速斷頭分離出新鮮的海馬組織后，保存在液氮中。取研磨后的新鮮組織加入含PMSF的裂解液抽提全細胞蛋白。用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒參照說明書提取細胞核蛋白與細胞漿蛋白。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳60分鐘，轉(zhuǎn)膜90分鐘。封閉液封閉2小時后置于一抗稀釋液(SIRT1 1∶2 000；FOXO3A 1∶2 000)4°C孵育過夜。次日洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液(1∶2 000)孵育60分鐘，將膜片置于X光片盒中于暗室中感光、顯影、定影。最后清水沖洗，晾干保存，掃描。IPP軟件分析各條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠逃避潛伏期變化

重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，時間因素有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢。時間和分組的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同。

與空白對照組同期對比，第2天模型組的逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，從第3天開始模型組與空白對照組間的差異顯著(P<0.01)，提示APP/PS1模型小鼠造模成功。與模型組同天比較，電針組第4天、第5天的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，電針+抑制劑組第5天的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)?？瞻讓φ战M、電針組、電針+抑制劑組第4天、第5天與第2天比較有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。見表1，圖1。

表1 各組AD模型小鼠第四象限入水逃避潛伏期的變化秒)

圖1 各組AD模型小鼠逃避潛伏期變化趨勢圖

2.2 小鼠空間探索實驗

與空白對照組對比，模型組小鼠穿越站臺次數(shù)及原站臺所在象限運動距離百分比顯著減少(P<0.01)。與模型組對比，電針組穿越原站臺次數(shù)明顯增多(P<0.05)，在目標象限的運動距離百分比明顯擴大(P<0.05)，電針+抑制劑組穿越原站臺次數(shù)及Ⅰ象限運動距離百分比僅有增長趨勢，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組AD模型小鼠站臺進入次數(shù)及Ⅰ象限運動距離百分比的比較

2.3 小鼠海馬區(qū)HE染色

空白對照組小鼠海馬DG區(qū)顆粒層神經(jīng)細胞數(shù)量較多，排列規(guī)則、緊密，核仁清晰；與空白對照組對比，模型組顆粒層神經(jīng)細胞減少，排列散亂，胞核深染，部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞核固縮，胞體縮小、胞核溶解。電針組顆粒細胞層比模型組較厚，核固縮狀態(tài)、胞核染色及胞核溶解情況明顯好于模型組。電針+抑制劑組核溶及核縮情況介于模型組與電針組之間。見圖2。

注：A空白對照組;B模型組;C電針組;D電針+抑制劑組。

2.4 小鼠海馬區(qū)SIRT1、總FOXO3A平均光密度表達

SIRT1主要定位在神經(jīng)元的細胞核內(nèi)，F(xiàn)OXO3A主要定位于細胞質(zhì)或細胞核中，陽性表達呈棕褐色。與空白對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)SIRT1平均光密度明顯降低(P<0.01)，總FOXO3A平均光密度明顯升高(P<0.01)，且主要定位在細胞質(zhì)中；與模型組比較，電針組小鼠SIRT1平均光密度明顯上升(P<0.01)，總FOXO3A平均光密度明顯下降(P<0.01)，且主要定位在細胞核中，電針+抑制劑組SIRT1平均光密度升高(P<0.01)，總FOXO3A平均光密度有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且其主要定位于細胞質(zhì)中。見圖3，表3。

圖3 各組AD模型小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A蛋白表達比較(免疫組化，×400)

表3 各組AD模型小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A平均光密度值比較

2.5 小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A(細胞核)、FOXO3A(細胞質(zhì))蛋白表達

與空白對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A(細胞核)蛋白表達顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)OXO3A(細胞質(zhì))蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，電針組小鼠FOXO3A(細胞質(zhì))蛋白表達顯著下降(P<0.01)，SIRT1、FOXO3A(細胞核)蛋白表達顯著升高(P<0.01)，電針+抑制劑組SIRT1、FOXO3A(細胞核)蛋白表達有所升高(P<0.05)，F(xiàn)OXO3A(細胞質(zhì))蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見圖4，表4。

注：A空白對照組;B模型組;C電針組;D電針+抑制劑組。

表4 各組AD模型小鼠海馬組織SIRT1、胞核FOXO3A、胞質(zhì)FOXO3A蛋白表達比較

3 討論

多項研究表明，SIRT1/FOXO3A信號通路的激活或抑制在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護作用[8-10]。研究證實，SIRT1通路可介導(dǎo)FOXO3A活化，通過去乙?；疐OXO3A，激活各種自噬相關(guān)蛋白的表達，之后恢復(fù)線粒體自噬[11-13]。對SIRT1/FOXO3A通路的研究可能有利于尋找治療AD的新靶點。SIRT1是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶的去乙酰化酶家族成員之一，參與調(diào)節(jié)多種與線粒體增殖和自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達及活性，對線粒體數(shù)量和質(zhì)量的調(diào)節(jié)起著主要作用[14-15]。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3A對自噬的調(diào)控作用與其在細胞內(nèi)的定位有關(guān)，當(dāng)其位于細胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄活性；相反，當(dāng)轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)時，則轉(zhuǎn)錄失活。SIRT1可通過去乙?；疐OXO3A，促進FOXO3A的核轉(zhuǎn)位從而提高其轉(zhuǎn)錄活性[16]。本研究的免疫組化及蛋白免疫印跡檢測實驗結(jié)果顯示：APP/PS1模型小鼠海馬區(qū)的SIRT1蛋白表達顯著下降，而總FOXO3A蛋白表達明顯升高，且模型組小鼠FOXO3A主要分布在細胞質(zhì)中；在經(jīng)電針干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達明顯升高，總FOXO3A蛋白表達明顯下降并主要分布于細胞核內(nèi)；但在電針治療的基礎(chǔ)上增加自噬抑制劑3-MA后，小鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達有所升高，總FOXO3A蛋白表達略有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義且分布在細胞質(zhì)中為多。電針組與電針+抑制劑組均能增加海馬區(qū)SIRT1、胞核FOXO3A的陽性表達和降低胞質(zhì)FOXO3A的陽性表達，但電針+抑制劑組的增加/降低幅度均比電針組小，這可能與3-MA自噬抑制劑限制了電針的干預(yù)效果有關(guān)。

中醫(yī)認為AD的病機主要為髓海不足，腦神失養(yǎng)。腦的正常生理活動與陽氣的溫煦和推動作用有著密切關(guān)系，督脈入絡(luò)腦，總督一身之陽氣，頭為百脈之宗，“百會”“印堂”“水溝”穴均位于頭面部、督脈上，其中“百會”穴位于頭頂部正中，“印堂”穴處于兩眉頭之正中，“水溝”穴在人中溝正中，均位于機體左右分界處，三穴同用共起通督啟神、調(diào)和陰陽之功效。大量臨床研究表明針刺在改善AD患者的相關(guān)癥狀，延緩其疾病進程的同時，針刺相比藥物治療副作用更少，顯著提高了AD患者的生活質(zhì)量[17]。本研究行為學(xué)實驗結(jié)果顯示：電針組可以提高APP/PS1小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及記憶保持能力，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示電針組能改善海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷程度，均提示電針組治療效果優(yōu)于電針+抑制劑組。

AD是世界范圍內(nèi)老年性癡呆最常見的原因。AD腦的組織病理學(xué)特征是細胞外淀粉樣斑塊(包含淀粉樣β肽)和神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(包含過度磷酸化的Tau蛋白)[18]?！熬€粒體級聯(lián)假說”[19]認為AD早期病理表現(xiàn)與線粒體功能障礙關(guān)系密切,有證據(jù)表明在早期AD患者/動物模型的大腦中存在明顯的線粒體功能障礙[20-21]。最近研究表明線粒體自噬存在障礙時，會引起氧化損傷和細胞能量的缺乏，最終使β淀粉樣蛋白和Tau蛋白異常堆積，從而導(dǎo)致突觸功能障礙和認知缺陷，引發(fā)AD[22]。因此在AD早期進行干預(yù)以提高自噬或線粒體自噬水平，從而及時清除嚴重受損的線粒體，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，可能是治療AD的新途徑。

綜上所述，“通督啟神”法電針能夠明顯上調(diào)APP/PS1小鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達，促進FOXO3A核轉(zhuǎn)位，提高FOXO3A的轉(zhuǎn)錄活性，改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和記憶保持能力。但FOXO3A是否提高了PINK1、BNIP3等與自噬/線粒體自噬相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，還需進一步的深入研究。