心可舒調(diào)控TGF-β1和間質(zhì)膠原酶表達(dá)抑制心肌纖維化的機(jī)制

★ 饒斌 涂艷 李芬 陳傳軍（.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 南昌 005；.江西省惠民醫(yī)院 南昌 0046；.南昌樂悠生物科技有限公司 南昌 0046）

適應(yīng)不良的病理變化導(dǎo)致心肌梗塞后心臟重塑過(guò)程中的心力衰竭，包括心肌細(xì)胞肥大，炎癥和纖維化增強(qiáng)[1-2］。一些證據(jù)表明心臟成纖維細(xì)胞增殖和過(guò)度的細(xì)胞外基質(zhì)沉積誘導(dǎo)心肌纖維化并導(dǎo)致心室功能障礙，心室擴(kuò)張和心力衰竭[3］。肌成纖維細(xì)胞從成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化而來(lái)，在纖維化中發(fā)揮重要作用[4］。然而，心肌纖維化的確切病因和可用的藥理學(xué)干預(yù)被消除仍然很少被研究。因此，迫切需要尋求用于改善心肌纖維化功能恢復(fù)的新型治療策略。以前的強(qiáng)化研究已經(jīng)注意到轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)的各種疾病的細(xì)胞外基質(zhì)和纖維化，包括心臟成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[5-6］。TGF-β1功能由TGF-βI型和II型受體介導(dǎo)[7］。在一些研究中，已經(jīng)證明各種中藥材料可以安全地抑制促炎和促纖維化途徑并控制心肌纖維化[8］。心可舒主要生物活性成分丹參、葛根、木香、三七、山楂，在傳統(tǒng)中醫(yī)中被廣泛使用[9］。它具有很少的副作用，可用于治療心血管疾病，腦血管疾病，糖尿病和糖尿病并發(fā)癥。最近研究發(fā)現(xiàn)，心可舒通過(guò)其抗炎，抗氧化作用證明它對(duì)心臟重塑具有治愈和抗纖維化作用[10］。鑒于以上幾點(diǎn)，我們認(rèn)為心可舒可通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)通路和間質(zhì)膠原酶表達(dá)來(lái)消除心臟纖維化。為此，我們開發(fā)了一種小鼠模型來(lái)研究心可舒是否是心肌梗塞誘導(dǎo)的心臟纖維化的潛在治療化合物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從動(dòng)物中心購(gòu)買體重18～22 g的C57BL/6J雄性小鼠（購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào)為SCXK-〈軍〉2012-0004），在溫度（24 ℃）和正常光明/黑暗循環(huán)（上午8:00～晚上8:00的光照）下飼養(yǎng)動(dòng)物，自由獲取食物和水。

1.1.2 心肌梗塞模型 通過(guò)LAD冠狀動(dòng)脈的手術(shù)結(jié)扎產(chǎn)生小鼠心肌梗塞（心肌梗塞）模型。簡(jiǎn)而言之，在用戊巴比妥鈉（50 mg/kg；購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)2015a-213695）初始麻醉后，將小鼠與氣管插管一起孵育。然后打開胸腔以暴露心臟，并將8-0絲線縫合用于LAD冠狀動(dòng)脈的永久性結(jié)扎?？p合線通過(guò)左耳廓尖端下方約2～3 mm處。用6-0絲線縫合將胸部逐層封閉。通過(guò)左心室前壁的蒼白顏色證實(shí)了心肌梗塞。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將20只存活的心肌梗塞小鼠和10只假小鼠（未結(jié)扎的胸廓切開術(shù)）分成3組，每組10只：假手術(shù)組（假小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水28 d）（對(duì)照組1）；心肌梗塞組（心肌梗塞小鼠腹腔注射等量生理鹽水28 d）（對(duì)照組2）；心肌梗塞+心可舒組（心肌梗塞小鼠腹膜內(nèi)每日注射200 mg/kg心可舒，共28 d；心可舒購(gòu)自四川科瑞德制藥股份有限公司，批號(hào)2018YBZ030-0508）（觀察組）。在心肌梗塞手術(shù)后48 h開始治療。心肌梗塞后4周，每組動(dòng)物用二氧化碳處死。心臟被采取進(jìn)一步檢查。對(duì)于組織學(xué)研究，在麻醉后用20 mL的0.01 mol/L PBS灌注心臟，然后灌注30 mL的4%多聚甲醛。然后將心肌樣品在4 ℃下浸入4%多聚甲醛中另外24 h并包埋在石蠟中。

1.3 方法

1.3.1 組織病理學(xué)檢查 將心肌組織樣品用4%聚甲醛固定，用水洗滌，用醇脫水，包埋在石蠟中并切成切片（厚度，4 μm）。根據(jù)Masson's染色試劑盒（南京森貝嘉生物科技有限公司，批號(hào)020581230）染色切片。制造商的說(shuō)明書并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2 透射電子顯微鏡觀察 將左心室心肌組織樣品切成薄片并用2.5%戊二醛固定，用1%四氧化鋨后固定，用磷酸沖洗液沖洗，用不同濃度的一系列丙酮（脫水，包埋并固化，并切成薄片（厚度，50～100 nm）。將超薄切片用3%乙酸鈾酰（上海財(cái)富生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ASS0206985）和硝酸鉛（中國(guó)營(yíng)口天韻工業(yè)精細(xì)化工有限公司，批號(hào)2015005289）在37 ℃下染色30 min。在透射電子顯微鏡下觀察樣品并保存圖像。

1.3.3 通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)膠原蛋白I的表達(dá) 將心肌組織樣品用4%聚甲醛固定，包埋在石蠟中，切成薄片（厚度，10 μm），脫蠟并水合。將切片與3%過(guò)氧化氫一起溫育，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，用10%正常山羊血清在37 ℃下封閉10 min。在37 ℃下與兔多克隆抗膠原蛋白I（稀釋度1∶100）一起孵育90 min，用PBS洗滌，在37 ℃下與第二抗體（稀釋度1∶2 000）一起孵育15 min，用PBS洗滌，在37 ℃下用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白孵育20 min，用PBS洗滌，用顯色試劑著色，用蘇木精在37 ℃染色。保持20 min，用酒精脫水并用中性樹脂密封。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡分析 在含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞透析緩沖液中提取總蛋白質(zhì)，并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒定量。通過(guò)配備有10%SDS-PAGE的電泳使蛋白質(zhì)變性，分離（40 μg蛋白質(zhì)/泳道），并轉(zhuǎn)移至PVDF膜（200 mA，110心肌梗塞n）。用含有5%脫脂乳的吐溫-20在37 ℃下將Tris緩沖鹽水封閉膜1 h。將膜在4 ℃下與以下適當(dāng)濃度稀釋的一抗孵育過(guò)夜：基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP8）（1∶400），MMP13（1∶400），基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP1）（1 ：400），Beclin 1（1∶1 000），Atg3（1∶1 000）和Atg7（1∶1 000）。用TBST緩沖液洗滌3次后，將膜與二抗（1∶8 000）在37℃溫育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑使條紋可視化，并使用Alpha Imager 2 200進(jìn)行分析。GAPDH作為內(nèi)部參考。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）分析 使用TRIzol試劑從各組小鼠的心肌組織中提取總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量提取的RNA的濃度，并用凝膠成像系統(tǒng)分析RNA的完整性。使用RT聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，用心肌梗塞-RNA特異性RT引物操作RT反應(yīng)。進(jìn)行RT-qPCR并在Thermo Scientific Piko-Real Real-Time PCR系統(tǒng)上分析。使用Taqman 心肌梗塞-RNA測(cè)定探針通過(guò)qPCR檢測(cè)TGF-β表達(dá)水平，并使用U6作為定量的上樣對(duì)照。 RT在以下條件下進(jìn)行：37 ℃ 15 min，42 ℃ 50 min和85 ℃ 5 min。將獲得的cDNA如下進(jìn)行qPCR：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)的相對(duì)定量。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國(guó)IBM公司）進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組心可舒對(duì)心肌梗塞小鼠心肌纖維化的影響

為了觀察心肌組織樣品中的組織病理學(xué)變化，使用Masson染色，藍(lán)色染色顯示心肌組織中的膠原纖維。與假手術(shù)組相比，在心肌梗塞組中觀察到不規(guī)則排列的心肌細(xì)胞和增加的纖維化。在心肌梗塞小鼠用心可舒處理后，心肌纖維的不規(guī)則排列程度和心肌纖維化降低。見圖1。

圖1 3組心肌梗塞小鼠心肌纖維化Masson染色圖

2.2 3組心可舒對(duì)Ⅰ型膠原表達(dá)水平的影響

通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)I型膠原蛋白的表達(dá)水平，旨在分子水平上闡明心肌纖維化。與對(duì)照組1比較，對(duì)照組2中I型膠原蛋白的表達(dá)水平增加（P＜0.05）。與對(duì)照組2比較，觀察組中I型膠原蛋白的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組膠原蛋白I的表達(dá)水平比較（ ±s，n=10）

表1 3組膠原蛋白I的表達(dá)水平比較（ ±s，n=10）

注：與對(duì)照組1比較，*P＜0.05；與對(duì)照組2比較，#P＜0.05。

組別 I型膠原蛋白觀察組 1.94±0.15#對(duì)照組1 1.54±0.15對(duì)照組2 4.33±0.47*

2.3 3組RT-qPCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA的表達(dá)

TGF-β1被認(rèn)為是與心肌纖維化密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組1比較，對(duì)照組2中TGF-β1 mRNA的表達(dá)增加（P＜0.05）。與對(duì)照組2比較，觀察組中TGF-β1 mRNA的表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 膠原蛋白I的表達(dá)水平

表2 3組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量比較（ ±s，n=10）

表2 3組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量比較（ ±s，n=10）

注：與對(duì)照組1比較，*P＜0.05；與對(duì)照組2比較，#P＜0.05。

組別 TGF-β1觀察組 1.63±0.24#對(duì)照組1 1.25±0.09對(duì)照組2 3.87±0.16*

2.4 3組心可舒對(duì)間質(zhì)膠原酶相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

膠原合成和降解的程度與MMP和TIMP的平衡密切相關(guān)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MMP8、MMP13和TIMP1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明與對(duì)照組1比較，對(duì)照組2的MMP8和MMP13蛋白表達(dá)水平升高，而TIMP1的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與對(duì)照組2比較，觀察組MMP8和MMP13的表達(dá)水平降低，TIMP1的表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 心可舒對(duì)間質(zhì)膠原酶相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 3組纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（ ±s，n=10）

表3 3組纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（ ±s，n=10）

注：與對(duì)照組1比較，*P＜0.05；與對(duì)照組2比較，#P＜0.05。

組別 MMP8 MMP13 TIMP1觀察組 0.87±0.11# 1.04±0.07# 3.07±0.18#對(duì)照組1 0.54±0.12 0.85±0.06 3.54±0.33對(duì)照組2 2.25±0.21*2.33±0.14*1.15±0.23*

2.5 3組心可舒對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響

為了評(píng)估心可舒對(duì)心肌梗塞小鼠心肌組織自噬水平的影響，用透射電子顯微鏡觀察各組的自噬體。在心肌梗塞組模型中觀察到自噬體，而在假手術(shù)組中未發(fā)現(xiàn)可觀察到的自噬體。為了進(jìn)一步闡明心肌組織中的自噬水平，通過(guò)蛋白質(zhì)印記檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、Atg3和Atg7 蛋白表達(dá)，與對(duì)照組1比較，對(duì)照組2Beclin 1、Atg3和Atg7的表達(dá)水平增加（P＜0.05）。用心可舒處理后，Beclin 1，Atg3和Atg7的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 心可舒對(duì)心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

表4 3組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（ ±s，n=10）

表4 3組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（ ±s，n=10）

注：與對(duì)照組1比較，*P＜0.05；與對(duì)照組2比較，#P＜0.05。

組別 Beclin 1 Atg3 Atg7觀察組 1.64±0.37# 1.36±0.08# 1.08±0.11#對(duì)照組1 1.52±0.16 1.15±0.12 0.85±0.06對(duì)照組2 3.43±0.28*2.87±0.21*2.59±0.14*

3 討論

已經(jīng)證實(shí)心可舒參與心血管系統(tǒng)的各種生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)，并且某些研究表明心可舒在許多心臟損傷模型中發(fā)揮重要的保護(hù)作用，包括病毒性心肌炎，心肌缺血再灌注損傷和糖尿病性心肌病[11-13］。在這項(xiàng)研究中，我們提供證據(jù)表明心可舒通過(guò)減弱TGF-β1和MMP的表達(dá)來(lái)抑制心肌梗塞誘導(dǎo)的心臟纖維化。一些研究表明愈合和瘢痕形成過(guò)程和隨后的纖維化始終是心肌梗塞的結(jié)果。心肌梗塞建立后第4周，心肌梗塞小鼠可觀察到一系列病理改變，包括梗塞和邊緣區(qū)心臟纖維化，I型膠原表達(dá)增加，而心可舒減弱心肌梗塞的病理變化，例如心肌組織中肌成纖維細(xì)胞募集，膠原合成和纖維化形成這些結(jié)果表明心可舒對(duì)心臟纖維化具有抗纖維化作用，這與其他組織中顯示的結(jié)果一致。

目前，心肌梗塞的發(fā)病率逐漸增加，在心肌梗塞的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，心肌可能發(fā)生各種病理改變，包括心肌纖維化?，F(xiàn)有研究表明，心肌纖維化是心肌梗塞發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14］。心肌纖維化是指心肌間質(zhì)中過(guò)多的膠原纖維積聚，所有類型膠原的不成比例和膠原纖維的無(wú)序排列。在本研究中，觀察到心肌梗塞模型小鼠心肌纖維紊亂，并且根據(jù)Masson染色，在模型組小鼠的心肌組織中也觀察到心肌膠原蛋白積聚。此外，免疫組織化學(xué)顯示模型組中的膠原蛋白I的表達(dá)水平與假手術(shù)組相比增加。MMPs是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白聚集的重要因子，TIMPs作為MMPs的特異性抑制劑，可調(diào)節(jié)MMPs的活性，二者共同促進(jìn)心肌組織中膠原蛋白的合成和降解[15］?，F(xiàn)有研究表明，上調(diào)MMPs的表達(dá)水平和下調(diào)TIMP的表達(dá)水平可能導(dǎo)致心肌間質(zhì)中膠原蛋白的合成并增加積聚，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生。在本研究中，分子水平上的結(jié)果表明模型組小鼠心肌組織中MMP8和MMP13蛋白表達(dá)水平升高，TIMP1蛋白表達(dá)水平降低，表明不成比例的MMPs / TIMP1導(dǎo)致心肌梗塞模型小鼠心肌纖維化的發(fā)生。

已經(jīng)證明自噬參與各種生理和病理過(guò)程。自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制，受損的細(xì)胞器和未使用的蛋白質(zhì)被破壞和再循環(huán)，以緩解細(xì)胞壓力并提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以促進(jìn)細(xì)胞存活。早期的一項(xiàng)研究表明，過(guò)量表達(dá)Beclin 1并且在壓力超負(fù)荷的轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌中自噬水平升高，并且還可能引起病理性心肌重塑[16］。早期的研究也報(bào)道了心可舒參與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。此外，已經(jīng)確定心可舒可以緩解心肌缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果表明，心肌梗塞組小鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，如Beclin 1、Atg3和Atg7均高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

TGF-β1通過(guò)激活成纖維細(xì)胞增生和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原的積累來(lái)促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生。先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，慢性鐵超負(fù)荷小鼠心肌纖維化模型中TGF-β1的表達(dá)水平增加，并且在由心肌纖維化引起的心肌纖維化中TGF-β1的表達(dá)水平增加。同型半胱氨酸。TGF-β1的上調(diào)可能導(dǎo)致廣泛的心肌纖維化并誘導(dǎo)自噬。本研究的結(jié)果表明，隨著自噬水平的增加，心肌梗塞組小鼠心肌間質(zhì)纖維化的機(jī)制可能與TGF-β1信號(hào)通路的激活有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，心可舒通過(guò)降低TGF-β和MMP表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬并減輕心肌纖維化，這有助于研究心肌梗塞心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制，為心肌梗塞的臨床治療提供了新思路。