生炙淫羊藿抗衰老活性比較及作用機制研究△

李丹婷，姜宇，欒雅格，李晴霞，康念欣，譚鵬

北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京102488

淫羊藿主要來源于小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.，箭葉淫羊藿E.sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.，柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai 的干燥葉[1]，主要功效有壯陽、強筋骨等。淫羊藿作為補腎中藥，已被不少報道證實具有抗衰老作用[2-3]。淫羊藿炮制方法來自于《雷公炮炙論》[4]，炮制淫羊藿應用油炙法，輔料為羊脂油。有研究發(fā)現(xiàn)，油炙淫羊藿較生品更能提高腎陽虛癥狀模型小鼠的交配能力和耐寒能力，提示炙淫羊藿溫腎助陽的功效強于生品[5-6]。因此，推測淫羊藿生品與炮制品的抗衰老作用可能有差異，本研究將觀察在生、炙淫羊藿提取物的暴露下，秀麗隱桿線蟲（以下簡稱線蟲）的壽命是否有差異，從而對淫羊藿炮制品的抗衰老功效進行初步的區(qū)分，以期為淫羊藿的臨床合理用藥提供參考。同時，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學探究淫羊藿抗衰老潛在靶點及相關(guān)通路，以期為進一步研究淫羊藿抗衰老原理機制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

N2 野生型線蟲、大腸埃希氏菌OP50（以下簡稱OP50）均由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學遺傳所惠贈。

1.2 試藥

淫羊藿生品飲片（產(chǎn)地為四川，批號為1704058）、羊脂油（產(chǎn)地為河北，批號為2014058）均購自北京市雙橋燕京中藥飲片廠，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院楊瑤珺教授鑒別為小檗科植物淫羊藿E.brevicomuMaxim.的干燥葉的炮制加工品，符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版規(guī)定。

瓊脂粉（批號為20200518）、蛋白胨（批號為20181206）、胰蛋白胨（批號為20180206）、膽固醇（批號為160612）均購自北京奧博拓達科技有限公司；氯化鈉（批號為20160105）、磷酸二氫鉀（批號為20190216）、氫氧化鉀（批號為20161124）、磷酸氫二鈉（批號為20160216）、氯化銨（批號為20150929）均購自北京化工廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無水乙醇（分析純，批號為110115）購自天津市致遠化學試劑有限公司；二甲基亞砜（天津市光復精細化工研究所，批號為20180320）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；酵母提取物（英國OXOID 公司，批號為1149159）；無氟尿嘧啶（上海麥克林生化技術(shù)有限公司，批號為C10238054）。

1.3 儀器

BS210S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；LT-CPS50C型立式高壓蒸汽滅菌器[立德泰勀（上海）科學儀器有限公司]；LRH-150型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SMZ745T型立式顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]；SB25-12 DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SKG-1601型電磁爐（佛山艾詩凱齊電氣有限公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 炙淫羊藿炮制與質(zhì)量檢測

炙淫羊藿由本課題組按照《中國藥典》2020 年版[1]炮制方法制備所得，再按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的含量測定方法（通則0512）測定，測得寶藿苷I 質(zhì)量分數(shù)為0.066 6%（≥0.030%）；淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B 和朝藿定C 的總質(zhì)量分數(shù)為2.84%（≥1.2%），表明炮制后所得炙淫羊藿符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

2.2 線蟲的一般培養(yǎng)

線蟲以O(shè)P50 為食，在無菌環(huán)境中，挑取OP50接種于LB 培養(yǎng)基50 mL 中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱12 h，再置于4 ℃冰箱中保存。取OP50 菌液100 μL涂布于冷卻凝固的線蟲生長（NGM）培養(yǎng)基上，于干燥處放置12 h即可使用。線蟲須在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約3 d傳代1次。

2.3 線蟲的同步化處理

在無菌的條件下，挑取50～60 條處于產(chǎn)卵期的成蟲于1 個新的涂有OP50 的培養(yǎng)基上，待成蟲產(chǎn)卵2 h后將其全部挑走。將產(chǎn)卵板置于無菌生化培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng)至L4時期。

2.4 含有生、炙淫羊藿藥液的OP50制備

將淫羊藿生品粉碎后過三號篩，加10 倍量70%乙醇超聲提取1 h，濃縮至無醇味，用2%的二甲基亞砜助溶[7]，加入去離子水分散得到淫羊藿藥液，4 ℃下保存。使用時吸取一定量淫羊藿藥液，用OP50菌液稀釋成所需質(zhì)量濃度。同法制備含炙淫羊藿藥液OP50。

2.5 生、炙淫羊藿對線蟲壽命影響研究

將同步化至L4 時期的線蟲分成對照組、生品組和炙品組，分別在涂有正常OP50、含生淫羊藿藥液的OP50及含炙淫羊藿藥液的OP50的培養(yǎng)基中暴露至成蟲后，每組隨機挑取30條成蟲至含有12.5 mg·L-1五氟尿嘧啶的NGM培養(yǎng)基中，繼續(xù)用藥液處理。3 d后轉(zhuǎn)移至NGM培養(yǎng)基中，繼續(xù)用藥液處理。每24 h計數(shù)1 次線蟲的存活數(shù)，直至所有線蟲死亡，每組實驗平行3次，從卵開始作為壽命實驗的第0天。

2.6 生、炙淫羊藿對線蟲抗熱應激作用研究

將同步化至L4時期的線蟲分成對照組、生品組和炙品組，分別在涂有正常OP50、含生淫羊藿藥液的OP50及含炙淫羊藿藥液的OP50的培養(yǎng)基中暴露至成蟲后，溫度升高至36 ℃進行熱應激反應，溫度升高時記為0時，每2 h計數(shù)1次線蟲的存活數(shù)，至所有線蟲死亡。每組實驗測試30條線蟲，平行3次。

2.7 生、炙淫羊藿對線蟲產(chǎn)卵數(shù)影響研究

將同步化的線蟲培養(yǎng)至L4 時期后，分成對照組、生品組和炙品組，再分別在涂有正常OP50、含生淫羊藿藥液的OP50 及炙淫羊藿藥液的OP50 的培養(yǎng)基中暴露至成蟲。隨機挑選10 條線蟲，在成蟲第1 天分別挑取至含有OP50 的培養(yǎng)基中，使其產(chǎn)卵，每隔24 h 給線蟲換新的培養(yǎng)基，保留所有產(chǎn)卵后的培養(yǎng)基，2 d后計數(shù)孵化的線蟲的數(shù)量。

2.8 生、炙淫羊藿對線蟲體彎曲影響研究

將同步化的線蟲培養(yǎng)至L4 時期后，分成對照組、生品組和炙品組，再分別在涂有正常OP50、含生淫羊藿藥液的OP50 及炙淫羊藿藥液的OP50 的培養(yǎng)基中暴露至成蟲。在成蟲的第2 天和第8 天挑選15 條轉(zhuǎn)移至沒有OP50 的培養(yǎng)皿板中，滴1 滴M9 緩沖溶液（磷酸氫二鈉14.6 g、氯化銨10 g、磷酸二氫鉀6.8 g、氯化鈉0.5 g，加水至1 L），2 min 后，顯微鏡放大至合適的倍數(shù)，記錄每條線蟲20 s 內(nèi)身體彎曲（完成1次正弦曲線）的次數(shù)。

2.9 統(tǒng)計學方法

2.10 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究淫羊藿抗衰老機制

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），查找淫羊藿的活性成分，調(diào)整口服生物利用度（OB）＞30%，類藥性（DL）＞0.18，對淫羊藿的活性成分做進一步篩選。再通過主要活性成分的MOL ID，利用TCMSP 的相關(guān)靶點的檢索功能（Related Targets），依次得到其對應的潛在作用靶點，并且應用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），輸入靶點名稱，限定物種為“智人”，檢索得到靶點名稱對應的Gene symbol。以“anti-aging”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中檢索已認證的與抗衰老相關(guān)的基因。將淫羊藿活性成分靶點和與衰老相關(guān)作用靶點取交集，找出淫羊藿抗衰老的潛在作用靶點，利用微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）做韋恩圖，并用Cytoscape v3.6.1 軟件構(gòu)建淫羊藿活性成分-抗衰老靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

將上述得到的淫羊藿活性成分靶點和與抗衰老相關(guān)作用靶點的交集輸入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇物種為“人”，并限定交互作用＞0.4，構(gòu)建淫羊藿抗衰老靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。將在STRING 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.6.1 軟件中，調(diào)整Betweenness Centrality 值、Closeness Centrality 值 和Degree 值篩選出核心作用靶點，并構(gòu)建核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

將共有抗衰老靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/），進行基因本體（GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。限定物種為“智人”，設(shè)定閾值P＜0.05，即得到功能富集分析中生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組成（cellular component，CC）及KEGG 通路富集分析結(jié)果。再通過微生信網(wǎng)站將其結(jié)果可視化。

3 結(jié)果

3.1 生、炙淫羊藿對線蟲壽命影響研究

通過預實驗確定生藥質(zhì)量濃度64 mg·mL-1為最佳給藥濃度。將其對線蟲壽命的影響結(jié)果繪制成存活率曲線圖（圖1）。由圖1 可看出對照組線蟲的最大存活時間為22 d，淫羊藿生品組最大存活時間為21 d，淫羊藿炙品組最長存活時間為27 d，經(jīng)對數(shù)秩檢驗（Log-rank）分析可知炙品組與對照組線蟲壽命存活曲線差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明此質(zhì)量濃度下，炙淫羊藿能夠明顯延長線蟲的壽命。

3.2 生、炙淫羊藿對線蟲抗熱應激作用研究

如圖2 所示，熱應激下對照組線蟲最長存活時間為7 h，淫羊藿生品、炙品組線蟲最長存活時間分別為8、9 h，差異無統(tǒng)計學意義，表明此質(zhì)量濃度下，生、炙淫羊藿對線蟲抗熱應激無明顯作用。但炙品組的平均存活時間大于生品組和對照組。

圖2 線蟲抗熱應激實驗存活率曲線

3.3 生、炙淫羊藿對線蟲產(chǎn)卵數(shù)影響研究

測定每組線蟲的產(chǎn)卵數(shù)結(jié)果見圖3，生、炙淫羊藿組與對照組差異無統(tǒng)計學意義，表明此質(zhì)量濃度下，生、炙淫羊藿對線蟲生殖功能無明顯作用。

圖3 線蟲產(chǎn)卵數(shù)實驗（, n=10）

3.4 生、炙淫羊藿對線蟲體彎曲影響研究

線蟲一般情況下會做正弦運動，其運動頻率會隨生存時間的延長而下降。本實驗測定其成蟲后第2天和第8天的體彎曲頻率，如圖4A所示，在第2天用生、炙淫羊藿藥液處理后線蟲的運動頻率與對照組差異無統(tǒng)計學意義；如圖4B，暴露至第8 天，與對照組比較，淫羊藿生、炙品組均能提高線蟲的體彎曲數(shù)，并且與對照組的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明生、炙淫羊藿都能增加老年線蟲的體彎曲率。生品組和炙品組兩者差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 生、炙淫羊藿對不同生存時間線蟲體彎曲影響（,n=15）

3.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究淫羊藿抗衰老機制

3.5.1淫羊藿的活性成分及作用靶點 從TCMSP中篩選得到淫羊藿的活性成分23 種，其對應的靶點有214個。通過GeneCards檢索篩選，獲取相關(guān)性得分＞5 的與抗衰老相關(guān)的靶點有512 個。取淫羊藿活性成分靶點和與抗衰老相關(guān)靶點的交集，并用微生信網(wǎng)站做韋恩圖（圖5），共同靶點有58個，與之相關(guān)重要的活性成分有6個（表1）。

表1 淫羊藿關(guān)鍵活性成分

圖5 淫羊藿活性成分-抗衰老靶點韋恩圖

3.5.2活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用Cytoscape

3.6.1 軟件構(gòu)建淫羊藿活性成分-抗衰老靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），共有64 個節(jié)點，58 條邊。6 種活性成分中，作用靶點較多的3個成分槲皮素（38個靶點）、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone（14個靶點）和1,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1,3-diol（3 個靶點）可能為淫羊藿抗衰老的關(guān)鍵活性成分。這表現(xiàn)出淫羊藿抗衰老機制具有的多活性成分、多靶點共同作用的特點。

3.5.3PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖7，共有58 個節(jié)點，744 條邊，平均節(jié)點度為25.7，平均局部聚類系數(shù)為0.781。其節(jié)點代表潛在靶點，節(jié)點與節(jié)點之間的連線代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)有相互作用，節(jié)點大小和顏色隨Degree 值調(diào)整，Degree 值越大，節(jié)點越大、顏色越偏向暖色；節(jié)點之間的連線隨兩節(jié)點作用強弱調(diào)整，作用關(guān)系越強，連接線越粗、顏色越偏向冷色。再通過Cytoscape 3.6.1 軟件篩選出核心靶點做成PPI 核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖8），節(jié)點和連線的大小及色調(diào)同圖7，可見蛋白激酶B1（Akt1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、半胱天冬酶-3（CASP3）、Myc 原癌基因蛋白（MYC）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、白細胞介素-6（IL-6）、雌激素受體1（ESR1）、腫瘤壞死因子（TNF）等靶點位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，在PPI 網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖7 淫羊藿與抗衰老交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖8 淫羊藿與抗衰老交集靶點的核心蛋白相互作用圖

3.5.4GO 與KEGG 通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫，將58 個交集靶點GO 富集分析，設(shè)置P＜0.05 篩選條件，得到16 個BP 條目、14 個CC 條 目、20 個MF 條目。采用微生信網(wǎng)站將排名靠前的條目繪制條形圖（圖9）。GO 分析顯示，這些靶點在BP方面涉及對無機物的反應（response to inorganic substance）、對生長因子的反應（response to growth factor）、血管發(fā)育（blood vessel development）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、細胞死亡的正性調(diào)節(jié)（positive regulation of cell death）等生物過程。CC 方面涉及膜筏（membrane raft）、紡錘（spindle）、質(zhì)膜蛋白復合物（plasma membrane protein complex）、胞質(zhì)核周區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復合物（RNA polymerase Ⅱtranscription factor complex）等部位。MF 方面涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、激酶綁定（kinase binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、磷酸酶綁定（phosphatase binding）、激酶調(diào)節(jié)活動（kinase regulator activity）、蛋白質(zhì)同源二聚化活動（protein homodimerization activity）、脂質(zhì)結(jié)合（lipid binding）、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合（histone deacetylase binding）、蛋白酶綁定（protease binding）、細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、酶激活活動（enzyme activator activity）等功能。

圖9 淫羊藿與抗衰老交集靶點的GO富集分析

KEGG 共富集到225 條通路，設(shè)置P＜0.05 篩選條件，共得到20 條通路，篩選靠前的通路繪制氣泡圖（圖10）。結(jié)果顯示淫羊藿抗衰老的靶點主要涉及癌癥通路（30 個，51.72%）、乙型肝炎（20 個，34.48%）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（19 個，32.76%）、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路（17個，29.31%）、胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路（17 個，29.31%）、癌癥中蛋白聚糖（16 個，27.59%）、鉑耐藥性（12 個，20.69%）、類風濕性關(guān)節(jié)炎（8 個，13.79%）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路（7個，12.07%）、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)（7個，12.07%）等信號通路。

圖10 淫羊藿與抗衰老交集靶點的KEGG通路富集分析

4 討論

淫羊藿通過延長壽命、抗應激，保護生殖、神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官等方式來實現(xiàn)抗衰老的作用。有研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿能通過改善肌肉萎縮、減緩有關(guān)肝臟衰老癥狀、恢復衰老小鼠睪丸功能抗衰老作用[8-9]。此外，有實驗研究表明炮制淫羊藿時，其有效成分異戊烯基黃酮類成分可能會發(fā)生氧化、環(huán)合、酯化等反應[10]。這些有效成分的變化可能會促使抗衰老作用的發(fā)生。

本研究比較淫羊藿炮制前后對線蟲抗衰老作用的差異，從抗衰老角度闡釋了淫羊藿炮制增效的科學內(nèi)涵。結(jié)果顯示，生、炙淫羊藿能延緩線蟲的衰老，且炙淫羊藿延長線蟲壽命的作用優(yōu)于生淫羊藿；生、炙淫羊藿均能提高老年線蟲的體彎曲率，表明生、炙淫羊藿對老年線蟲的體彎曲均有改善作用。有研究表明，淫羊藿總黃酮可延緩線蟲衰老且不損害其生殖功能，且能顯著提高其抗熱應激的能力[2]。本研究采用生、炙淫羊藿飲片醇提并給藥，其成分復雜且成分之間相互作用，更還原臨床藥效，更能科學地闡釋淫羊藿炮制前后的抗衰老作用及差異。在本研究前期，通過參考文獻[7]選擇含生藥量4、32、40、64 mg·mL-1的生、炙淫羊藿藥液進行預實驗，經(jīng)過篩選最終確定了壽命實驗中淫羊藿炙品組與對照組差異有統(tǒng)計學意義的給藥質(zhì)量濃度64 mg·mL-1進行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示，在此實驗濃度下，實驗組和對照組相比，線蟲的產(chǎn)卵量差異無統(tǒng)計學意義，表明該質(zhì)量濃度下淫羊藿和炙淫羊藿藥液對線蟲的正常發(fā)育繁殖無影響，綜合壽命實驗結(jié)果表明在該濃度下，炙淫羊藿能在不影響線蟲正常繁殖能力的情況下延長其的壽命，發(fā)揮抗衰老作用。

此外，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選得到潛在關(guān)鍵活性成分有槲皮素、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenylchromone、1,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1,3-diol等6 種成分。有研究表明，淫羊藿總黃酮可通過抗氧化、抗炎、促進細胞增殖等多方面延緩衰老[3]，其中淫羊藿苷可通過影響神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌、生殖等系統(tǒng)發(fā)揮抗衰老作用[11]，高劑量的槲皮素能顯著延長線蟲的平均壽命[12]。而本研究還預測出其他幾種潛在抗衰老關(guān)鍵成分，但相關(guān)報道較少，可為后續(xù)淫羊藿抗衰老成分研究提供參考。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學，本研究篩選出了關(guān)鍵蛋白Akt1、TP53、MAPK1、CASP3、MYC、MAPK8、JUN、IL-6、ESR1、TNF 等。研究發(fā)現(xiàn)，AKT1[13]、TP53[14]蛋 白可以通過PI3K-Akt 信號通路參與抗衰老過程，CASP3[15]蛋白與細胞凋亡相關(guān)，MYC[16]、JUN[17]、IL-6[18]和TNF[18]蛋白與抗衰老相關(guān)。同時，本研究預測了淫羊藿抗衰老的相關(guān)通路，分別是癌癥通路、乙型肝炎、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中蛋白聚糖、鉑耐藥性、VEGF 信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等。研究表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物/晚期糖基化終產(chǎn)物受體/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（AGEs/RAGE/NF-κB）通路可能與老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病有關(guān)[19]，PI3K-Akt 信號通路的激活可減緩H2O2誘導的心肌細胞衰老[20]，沉默血管內(nèi)皮細胞生長因子受體1（VEGFR1）可能會促進人β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）誘導的人腦微血管內(nèi)皮細胞衰老及凋亡[21]。由此可進一步探討淫羊藿的抗衰老作用是否與上述潛在靶點及通路有關(guān)，從而進行淫羊藿抗衰老作用機制的深入研究。