吲哚酚類糖苷酶顯色底物6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷的合成工藝研究

尹 偉，胡 琪，李新章，周清浩，范高福，胥振國

（1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 合肥 238000；2.南通睿灃新材料技術(shù)有限公司 化學(xué)成分分析中心，江蘇 南通 226000；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)高分子科學(xué)與工程系 中科院軟物質(zhì)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230026）

近年來， 由病原微生物導(dǎo)致的疾病， 如禽流感（H7N9、H5N1）、非典型肺炎（SARS）以及目前仍在全球肆虐的新型冠狀病毒（2019-nCoV）等所感染的疾病，傳染性都極強(qiáng)，通常能夠造成世界性的大流行［1-4］，因此在對病原微生物的檢測方面，務(wù)必做到精準(zhǔn)、快速、高效和簡便。 傳統(tǒng)的病原微生物檢測方式具有一定的局限性，檢測過程較為繁瑣，檢測持續(xù)周期長，亦可能出現(xiàn)一定的誤差。

顯色培養(yǎng)基是指在傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)基中加入了一類特殊的化學(xué)合成底物的新型培養(yǎng)基，在微生物培養(yǎng)過程中， 通過微生物代謝產(chǎn)生特異性的酶而顯色，最終根據(jù)不同顏色對各菌群進(jìn)行鑒別［5-7］。培養(yǎng)基顯色底物主要有4-甲基傘形酮類、吲哚酚類等，此方法在微生物的檢測應(yīng)用上，有效提高了病原微生物檢測的準(zhǔn)確性，同時(shí)又大大縮短了檢測時(shí)間，應(yīng)用前景十分廣泛。

有研究報(bào)道［8-9］，利用苯胺、鹵代物、N-（2-羧基）苯基甘氨酸及2-氯-6-氟苯甲醛等作為起始合成原料合成吲哚酚類顯色底物，終產(chǎn)物的收率、純度以及反應(yīng)時(shí)間均存在一定的不足。 本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上， 以常見試劑鄰氨基苯甲酸為原料合成吲哚酚類糖苷酶顯色底物6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷，通過鹵化等反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物， 整體收率有大幅度的提升，顯現(xiàn)出很多優(yōu)點(diǎn)：（1）初始原料鄰氨基苯甲酸價(jià)格低廉，容易購買；（2）合成路線步驟相對較少；（3） 實(shí)驗(yàn)過程中涉及的易燃易爆有毒等化學(xué)試劑較少，相對環(huán)保。 上述多方面的合成優(yōu)點(diǎn)為此顯色底物的綜合利用提供了強(qiáng)有力的保障。 同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中對所有合成中間體進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，優(yōu)化了該檢測底物的合成工藝路線，以期高效簡便地合成此目標(biāo)化合物。

1 合成路線的選擇

吲哚酚類顯色底物的合成改造主要集中在苯環(huán)上， 一般都是在這些位置引入鹵素或硝基等進(jìn)行修飾，以達(dá)到既保證其具有較好的顯色效果，又降低合成的原料成本，提高目標(biāo)物收率的目的。 在參考了相關(guān)文獻(xiàn)［10］之后，最終確定了合成方案，見圖1。

圖1 顯色底物6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷的合成工藝路線

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

（1）實(shí)驗(yàn)試劑：鄰氨基苯甲酸［西亞化學(xué)科技（山東）有限公司］，冰醋酸（河北鴻韜生物工程有限公司），雙氧水（安德化工有限公司），NaHSO3（宜興市錦程化工有限公司），NaOH（四川佰春科技有限責(zé)任公司），氯乙酸鈉（淄博魯碩化工有限公司），碳酸鈉（濟(jì)南元素化工有限公司），鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸酐（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙醇（濟(jì)寧博誠化工有限公司），CH2Cl2（濟(jì)南啟辰化工有限公司），無水硫酸鎂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），無水硫酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CH3ONa（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CH3OH（濟(jì)寧博誠化工有限公司），乙酸乙酯（山東辰宇化工有限公司）。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠），電子天平（MF1035C，濟(jì)南愛來寶儀器設(shè)備有限公司），真空干燥箱（DZF-6210A，蘇州納美瑞電子科技有限公司），集熱式加熱攪拌器（DF-101S，上海梅潁浦儀器儀表制造有限公司），紫外燈（ZF-2，杭州齊威儀器有限公司），循環(huán)水真空泵（SHZIII，上海亞榮生化儀器廠），硅膠柱（100～200 目，200～300 目，青島海洋化工有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.2.1 化合物7（5-碘-2-氨基苯甲酸）的合成

在100 mL 的三頸燒瓶中， 加入鄰氨基苯甲酸2.5 g（0.018 mol）、冰醋酸30 mL，攪拌溶解，隨后加入2.3 g（0.009 mol）碘粒，繼續(xù)攪拌，反應(yīng)液呈深棕色， 待燒瓶中固體完全溶解時(shí)， 滴加雙氧水0.31 g（0.009 mol，30%），在20 min 內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)體系升溫至60 ℃，反應(yīng)3.0 h。 每隔0.5 h，用TLC 點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況。待反應(yīng)完成后，將燒瓶中反應(yīng)產(chǎn)物緩慢倒入NaHSO3（1.0 mol/L，50 mL）中，繼續(xù)攪拌1.5 h，析出黃色固體，抽濾、用水洗滌3 次，最終得到黃色固體，收率達(dá)95.8%。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：7.90（d，J=2.2 Hz，1H），7.51（dd，J=8.5，2.2 Hz，1H），6.64（d，J=8.3 Hz，1H）。

2.2.2 化合物6（5-碘-2-羧基甲基氨基苯甲酸）的合成

在100 mL 的三頸燒瓶中加入5-碘-2-氨基苯甲酸2.5 g（0.01 mol）、NaOH 0.4 g（0.01 mol）及H2O 10.0 mL，攪拌0.5 h 至固體溶解，溶液澄清。 同時(shí)在燒杯中加氯乙酸鈉1.33 g（0.012 mol）、碳酸鈉1.0 g（0.012 mol）及H2O 30 mL，不斷攪拌至全溶解，隨后用恒壓滴液漏斗緩慢滴加至三頸燒瓶中，0.5 h滴加完畢，升溫至80 ℃，恒溫反應(yīng)18 h，在反應(yīng)過程中，用TLC 點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況，直至原料點(diǎn)沒有變化為止，停止反應(yīng)。使用10%鹽酸調(diào)pH 值（pH=3.0），過濾重結(jié)晶得到白色固體， 收率達(dá)60.6%。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6） δ：8.00 （d，J=2.1 Hz，1H），7.48（dd，J=8.7，2.1 Hz，1H），6.46（d，J=9.1 Hz，1H），3.96（s，2H）。

2.2.3 化合物5（N-乙?；?5-碘吲哚-3-乙酸酯）的合成

在100 mL 的三頸燒瓶中加入5-碘-2-羧基甲基氨基苯甲酸2.5 g（0.008 mol）、乙酸酐20.0 mL，攪拌溶解，在持續(xù)攪拌狀態(tài)下加入乙酸鈉2.9 g（0.07 mol），隨后反應(yīng)升溫至125 ℃，攪拌、回流反應(yīng)4.0 h。 反應(yīng)無氣泡產(chǎn)生時(shí)，停止反應(yīng)。 在攪拌下加入冰水，有固體產(chǎn)生，繼續(xù)攪拌1.0 h 后，在4 ℃下放置過夜，抽濾得到深棕色固體。用硅膠柱純化［V（乙酸乙酯）∶V（石油醚）=1∶6］， 得固體收率為67.8%。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6） δ：8.13（d，J=8.5 Hz，1H），7.90（d，J=1.4 Hz，1H），7.11 （dd，J=8.5，1.8 Hz，1H），2.63 （s，3H），2.35（s，3H）。

2.2.4 化合物4（N-乙?；?6-氯-3 吲哚酮）的合成

在100 mL 的三頸燒瓶中加N-乙?；?6-氯吲哚-3-乙酸酯1.5 g（0.006 mol）、乙醇20 mL，攪拌至固體完全溶解，同時(shí)將Na2SO31.83 g（0.015 mol）溶于15.0 mL H2O 中，緩慢滴加至三頸燒瓶中，0.5 h 滴加完畢，隨后升溫至回流，反應(yīng)8 h。 反應(yīng)過程中用TLC 點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況。 反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將溶液轉(zhuǎn)移至單口瓶中，減壓濃縮除去乙醇，加入乙酸乙酯萃取3次，用無水硫酸鈉干燥，最終得到固體產(chǎn)物，收率達(dá)87.2%。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：8.42（s，1H），7.65 （d，J=7.9 Hz，1H），7.30 （dd，J=8.1，1.7 Hz，1H），4.62（s，2H），2.25（s，3H）。

2.2.5 化合物3（溴代四乙酰葡萄糖）的合成

向250 mL 的三頸燒瓶中加入五-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖5.0 g（0.013 mol）、干燥CH2Cl2100 mL，攪拌溶解，整個(gè)過程于冰浴中進(jìn)行，將HBr 的冰醋酸溶液（45%，30 mL）緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，滴加完畢后， 室溫?cái)嚢?2 h， 整個(gè)反應(yīng)過程用TLC 點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況。反應(yīng)結(jié)束后，加入CH2Cl2（50 mL），用飽和NaHCO3溶液洗滌5 次。 分出有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓濃縮，得淡棕色油狀物，用石油醚及乙醚混合溶劑重結(jié)晶， 得到白色固體， 收率達(dá)90.3%。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：6.60（d，J=3.91 Hz，1H），5.51（t，1H），5.22 （t，1H），4.83 （t，1H），4.31（m，2H），4.15（m，1H）。

2.2.6 化合物2 ［（1-乙?；?6-氯吲哚-3-基）-2，3，4，6-四乙酰基-β-D-葡萄糖苷］的合成

在N2保護(hù)及冰浴條件下， 向100 mL 的三頸燒瓶中加入N-乙酰基-6-氯-3-吲哚酮1.00 g（0.005 mol）、NaNH20.2 g（0.005 mol）及CH2Cl250 mL，攪拌1 h。用CH2Cl2（30 mL）溶解溴代四乙酰葡萄糖3.93 g（0.01 mol），滴加至三頸瓶中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12 h，整個(gè)反應(yīng)過程用TLC 點(diǎn)板跟蹤反應(yīng)情況。 反應(yīng)結(jié)束后分液，用無水硫酸鈉干燥，使用柱色譜法［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯） =3∶1］純化及乙醇重結(jié)晶，得到白色固體，收率達(dá)48.9%。1H-NMR （500 MHz，DMSOd6） δ：8.32（s，1H），7.51（s，1H），7.42（d，J=8.2 Hz，1H），7.35（dd，J=8.0，2.1 Hz，1H），5.51（d，J=8.2 Hz，1H），5.42（t，J=9.7 Hz, 1H），5.15（dd，J=9.9，8.2 Hz，1H），5.08 （t，J =9.7 Hz，1H），4.09 ～4.25 （m，3H），2.65（s，3H），2.02（dd，J=19.0，17.4 Hz，12H）。

2.2.7 化合物1 （6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷）的合成

向100 mL 的三頸燒瓶中加入（1-乙?；?6-氯吲哚-3-基）-2，3，4，6-四乙酰基-β-D-葡萄糖1.0 g（0.002 mol）、無水CH3OH 40 mL，攪拌1 h，隨后加入KOH 0.1 g（0.002 mol），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4.0 h，溶液濃縮，有固體產(chǎn)生，抽濾，用甲醇洗滌，干燥，使用硅膠柱色譜法（純乙酸乙酯）純化，最終得到產(chǎn)物，收率達(dá)90.3%。1H-NMR （500 MHz，DMSO-d6） δ：10.67（s，1H），7.53 （d，J=8.4 Hz，1H），7.31 （d，J= 1.6 Hz，1H），7.17 （d，J =2.2 Hz，1H），6.92 （dd，J =8.6，1.8 Hz，1H），5.36（d，J=4.5 Hz，1H），5.22（d，J=4.3 Hz，1H），5.02（d，J=5.6 Hz，1H），4.63（t，J=5.9 Hz，1H）,4.59（d，J=7.2 Hz，1H），3.65 ～3.78（m，1H），3.55（dt，J=11.4，6.2 Hz，1H），3.22（tt，J=7.5，3.7 Hz，3H），3.12（td，J=9.1，8.7，4.8 Hz，1H）；13C-NMR（125 MHz，DMSOd6）δ：137.8，133.8，126.7，119.5，119.0，112.7，111.6，104.7，77.7，77.1，73.9，70.6，61.5。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 化合物2 的合成影響因素

本研究對化合物（1-乙?；?6-氯吲哚-3-基）-2，3，4，6-四乙?；?β-D-葡萄糖苷的不同反應(yīng)工藝條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，旨在得到最佳的合成條 件［11-12］。 具體反應(yīng)式如圖2 所示。

圖2 化合物2 的合成路線

（1）反應(yīng)物投料比對生成物收率的影響

設(shè)定NaNH2的加入量為1 mol， 反應(yīng)物N-乙?；?6-氯-3-吲哚酮與溴代四乙酰葡萄糖的物質(zhì)的量比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，在室溫下反應(yīng)12 h，考察2 種化合物的投料比對反應(yīng)產(chǎn)物的影響。 結(jié)果見表1。 由表1 可知，當(dāng)N-乙?；?6-氯-3-吲哚酮的投料量恒定時(shí)， 增加化合物溴代四乙酰葡萄糖的量，能在一定程度上提高產(chǎn)物的收率；當(dāng)兩者的投料比達(dá)1∶3 時(shí)，產(chǎn)物的收率基本趨于穩(wěn)定，反應(yīng)過程接近平衡狀態(tài)； 繼續(xù)加入過多的溴代四乙酰葡萄糖，收率提高不明顯，而且會造成原料的浪費(fèi)，增加目標(biāo)產(chǎn)物合成的成本。 因此選定反應(yīng)物的投料比為1∶3。

表1 反應(yīng)物投料比對生成物收率的影響

（2）NaNH2的量對生成物收率的影響

以N-乙?；?6-氯-3-吲哚酮加入量1 mol 為基準(zhǔn)， 反應(yīng)物料N-乙酰基-6-氯-3-吲哚酮和溴代四乙酰葡萄糖的物質(zhì)的量比為1∶3，N-乙?；?6-氯-3-吲哚酮與NaNH2的物質(zhì)的量比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，在室溫下反應(yīng)12 h，考察NaNH2的量對生成物收率的影響。 結(jié)果見表2。 由表2 可知，適量地增加NaNH2的投料量，在一定程度上能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行， 但是當(dāng)NaNH2過量到一定程度時(shí)，NaNH2會影響溴代四乙酰葡萄糖的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響生成物的收率。 因此確定反應(yīng)中N-乙酰基-6-氯-3-吲哚酮與NaNH2的物質(zhì)的量比為1∶2。

表2 NaNH2 量對生成物收率的影響

（3）反應(yīng)時(shí)間對生成物收率的影響

設(shè)定反應(yīng)物N-乙?；?6-氯-3-吲哚酮與溴代四乙酰葡萄糖的物質(zhì)的量比為1∶3、N-乙?；?6-氯-3-吲哚酮與NaHN2的物質(zhì)的量比為1∶2，在室溫下分別反應(yīng)8、10、12 和14 h， 探究反應(yīng)時(shí)間對生成物收率的影響。 結(jié)果見表3。 由表3 可知，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行12 h 時(shí)，產(chǎn)物收率最大。

表3 反應(yīng)時(shí)間對生成物收率的影響

2.3.2 化合物1 的合成影響因素［12-13］

本實(shí)驗(yàn)中6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷的合成路線的具體反應(yīng)式如圖3 所示。

圖3 化合物1 的合成路線

（1）不同堿對產(chǎn)物收率的影響

設(shè)定（1-乙?；?6-氯吲哚-3-基）-2，3，4，6-四乙?；?β-D-葡萄糖的投料量為1 mol， 不同堿（K2CO3、KOH、 NaOH 、NaNH2）的用量也為1 mol，在室溫下反應(yīng)4 h，考察不同堿對產(chǎn)物收率的影響。 結(jié)果見表4。 由表4 可知， 當(dāng)反應(yīng)過程中選取KOH 作為堿時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的收率最高。

表4 不同堿對產(chǎn)物收率的影響

（2）KOH 的量對產(chǎn)物收率的影響

設(shè)定（1-乙?；?6-氯吲哚-3-基）-2，3，4，6-四乙酰基-β-D-葡萄糖的投料量為1 mol，KOH 的用量分別為0.5、1.0、1.5 和2.0 mol，在室溫下反應(yīng)4 h，考察KOH 用量對產(chǎn)物收率的影響。結(jié)果見表5。由表5 可知，當(dāng)（1-乙?；?6-氯吲哚-3-基）-2，3，4，6-四乙?；?β-D-葡萄糖與KOH 的投料比為1∶1 時(shí)， 反應(yīng)產(chǎn)物的收率最大，增加堿的量，產(chǎn)物收率并未有明顯變化。

表5 KOH 用量對產(chǎn)物收率的影響

3 討論與結(jié)論

近些年，顯色培養(yǎng)基在食品行業(yè)、醫(yī)藥臨床等病原微生物的檢測領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，它有效保證了病原微生物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)又保證了檢測過程的時(shí)效性， 簡化了傳統(tǒng)病原微生物檢測過程［13-15］。吲哚酚類糖苷酶顯色底物β-D-葡萄糖苷是病原微生物檢測過程中常見的底物， 具有檢測靈敏度高、操作簡單等特點(diǎn)。

葡萄糖苷的構(gòu)型主要分為α 與β 兩種， 其中，β-D-葡萄糖苷具有動力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)型［16］，有文獻(xiàn)報(bào)道［17-18］，葡萄糖苷的合成產(chǎn)物中大多數(shù)都以α 與β的混合構(gòu)型同時(shí)存在， 若能有效合成具有單一構(gòu)型的β-葡萄糖苷，將在很大程度上提高病原微生物檢測的準(zhǔn)確性及靈敏度。

6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷主要用于能夠產(chǎn)生β-D-葡萄糖苷酶的病原微生物的檢測，如大腸桿菌，大腸桿菌在自身代謝過程中產(chǎn)生β-D-葡萄糖苷酶，利用這一特性，檢測過程中，將6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷用作β-D-葡萄糖苷酶的檢測底物，在其水解后， 有效解離出游離的色原6-氯-3-羥基吲哚，同時(shí)經(jīng)過催化氧化反應(yīng)后，產(chǎn)生了肉眼可見顏色的雙吲哚產(chǎn)物， 進(jìn)而確定β-D-葡萄糖苷酶的存在，最終檢測出大腸桿菌病原微生物。

本文以試劑鄰氨基苯甲酸作初始原料， 經(jīng)過鹵化、?；?、水解等反應(yīng)，對吲哚酚類糖苷酶顯色底物6-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行了全合成，經(jīng)核磁氫譜對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征， 分析了合成過程中關(guān)鍵的影響因素（反應(yīng)時(shí)間、投料比及堿的用量等），最終確定了目標(biāo)化合物的最佳合成路線。 此合成路線具有原料簡單易得、 合成步驟較少及反應(yīng)條件相對溫和等特點(diǎn)， 為吲哚酚類糖苷酶顯色底物的綜合利用提供了技術(shù)支持。