甘蔗褐條病與梢腐病病原菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法

單紅麗，李銀煳，李婕，王曉燕，張榮躍，李文鳳，黃應(yīng)昆

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699）

0 引言

我國是世界上第三大食糖生產(chǎn)國和消費國，甘蔗是我國重要的糖料經(jīng)濟作物，蔗糖產(chǎn)業(yè)在促進邊疆地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展、農(nóng)民增收和鄉(xiāng)村振興中具有重要作用[1]。甘蔗褐條病和梢腐病是為害甘蔗葉部的災(zāi)害性真菌病害，廣泛分布于世界多個植蔗國家和地區(qū)，給當(dāng)?shù)卣崽钱a(chǎn)業(yè)帶來不同程度的經(jīng)濟損失[2-3]。近年多雨高濕加上感病品種規(guī)模化種植，導(dǎo)致甘蔗褐條病和梢腐病在云南、廣西蔗區(qū)為害成災(zāi)，損失嚴重[4-6]。多數(shù)蔗區(qū)因防治不及時、不到位，感病品種常使大量蔗莖枯死，甘蔗減產(chǎn)30%～48%，糖分降低2%～4%，經(jīng)濟損失巨大[5-7]。適時監(jiān)測病菌變異動態(tài)、致病力差異和篩選抗病品種是病害防控的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而監(jiān)測病菌變異動態(tài)、致病力差異、篩選抗病品種及綠色高效殺菌劑等應(yīng)用研究，均需要獲得大量的病菌分生孢子[8]。如何快速獲得足量的分生孢子成為當(dāng)前甘蔗褐條病和梢腐病理論研究和實踐工作中首要解決的問題及技術(shù)難點。改進和提高現(xiàn)有甘蔗褐條病和梢腐病病原菌產(chǎn)孢技術(shù)體系，有助于深入研究病原菌、精準監(jiān)測病菌變異動態(tài)、高效篩選抗病品種，為病害防控提供基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。為此，我們針對現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)的缺陷與不足，通過實驗對比，篩選出甘蔗褐條病與梢腐病病原菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，以滿足甘蔗褐條病和梢腐病深入研究與防控的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

本研究所用甘蔗褐條病菌菌株和梢腐病菌菌株均采集自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所基地，保存于云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室。

1.1.2 供試試劑

KH2PO4，KNO3，蔗糖，維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酰胺，泛酸鈣，維生素C，馬鈴薯，燕麥片，葡萄糖，瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

采集感染甘蔗梢腐病病葉，采用組織分離法分離病菌，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d 后挑取邊緣菌絲，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上純化獲得純化菌株。用真菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工生物股份有限公司）按說明書提取菌絲DNA，用通用引物ITS1/ITS4進行擴增，擴增得到的片段送華大基因公司測序，測序得到的片段在NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對，片段與數(shù)據(jù)庫登錄甘蔗梢腐菌菌株序列片段一致性為100%，則確定獲得菌株為甘蔗梢腐病病菌。褐條病菌分離鑒定方法同上。

1.2.2 產(chǎn)孢培養(yǎng)基制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：取馬鈴薯200 g，向其中加入適量超純水，電磁爐上加熱30 min，期間不斷攪拌，4 層紗布過濾，取濾液，向其中分別加入20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂粉，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基）：取馬鈴薯200 g，向其中加入適量超純水，電磁爐上加熱30 min，期間不斷攪拌，4層紗布過濾，取濾液，向其中加入20 g葡萄糖，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基：取30 g 燕麥片，向其中加入適量超純水，80 ℃水浴120 min，期間不斷攪拌，4層紗布過濾，取濾液，向其中加入17 g瓊脂粉，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

甘蔗梢腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基：在盛有100 mL超純水的容器中分別加入KH2PO41g、KNO31g、蔗糖0.5 g、維生素B1 3 mg、維生素B2 1.5 mg、維生素B6 0.2 mg、煙酰胺10 mg、泛酸鈣1mg、維生素C 100 mg，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

將混勻的培養(yǎng)基分裝在250 mL 三角瓶內(nèi)，121 ℃，105 kPa 高壓滅菌20 min，取出冷卻至50 ℃，得產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

1.2.3 甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢條件實驗

不同培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢的影響：取直徑4 mm 褐條病菌菌塊，分別接種于PDA 培養(yǎng)基和甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后測量孢子量。

不同光照處理對病原菌產(chǎn)孢的影響：取直徑4 mm 褐條病菌菌塊，接種于甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，28 ℃下分別置于24 h連續(xù)黑暗、12 h光照12 h黑暗條件下培養(yǎng)7 d后測量孢子量。

去除菌絲處理對病原菌產(chǎn)孢的影響:取直徑4 mm 褐條病菌菌塊，接種于甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，待菌落長至直徑5 cm 時，在超凈工作臺中用無菌棉簽將菌落的白色氣生菌絲除去，以未用無菌棉簽除去菌落白色氣生菌絲的培養(yǎng)皿為對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d后測量孢子量。

1.2.4 甘蔗梢腐病菌產(chǎn)孢條件實驗

將純化培養(yǎng)的甘蔗梢腐病菌菌絲用無菌手術(shù)刀刮取后，匯集到已滅菌的梢腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基中，200 r/min，27±2 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d后測量孢子量。

1.2.5 產(chǎn)孢量測定

甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢量測定：在產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面倒入適量無菌水，輕磨菌落，洗下分生孢子，用雙層無菌紗布過濾后在顯微鏡下計量分生孢子數(shù)。

甘蔗梢腐病菌產(chǎn)孢量測定：將甘蔗梢腐病病菌培養(yǎng)液分裝到無菌的50 mL 離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，收集沉淀，用無菌蒸餾水重懸，即可獲得甘蔗梢腐病菌的分生孢子。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗褐條病菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)

甘蔗褐條病菌培養(yǎng)7 d后，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上能夠看見大量灰褐色的分生孢子堆（圖1 a），產(chǎn)孢測定發(fā)現(xiàn)有大量分生孢子（圖1 c）；在PDA 培養(yǎng)基上菌落白色絮狀菌絲（圖1 b），未發(fā)現(xiàn)分生孢子，培養(yǎng)15 d 后鏡檢觀察到少量分生孢子（圖1 d）。

圖1 甘蔗褐條病菌菌落形態(tài)及分生孢子Fig.1 Colony and conidia of sugarcane brown stripe pathogen

甘蔗褐條病菌在24 h 連續(xù)黑暗條件下產(chǎn)孢量最大，達到3×102個/mL，12 h 光照12 h 黑暗條件下則不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量僅為3×101個/mL；去除菌絲處理后產(chǎn)孢量增大，達到4×102個/mL，而未用無菌棉簽處理的對照產(chǎn)孢量較少，僅為3×101個/mL。

2.2 甘蔗梢腐病菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)

甘蔗梢腐病菌在PDA 培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)所得菌落形態(tài)如圖2 a，為白色絮狀菌絲，取菌絲在梢腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)3 d 后，在10（目鏡）×40（物鏡）下顯微鏡下觀察20～40 個視野，平均每個視野可觀察到30～50 個分生孢子（圖2 b），而在PDB培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)3 d 后，平均每個視野僅可觀察到5～8 個分生孢子。

圖2 甘蔗梢腐病菌菌落形態(tài)及分生孢子Fig.2 Colony and conidia of sugarcane pokkah boeng pathogen

3 討論與結(jié)論

甘蔗褐條病病原菌屬無性菌類半知菌亞門叢梗孢目平臍孺孢屬。國內(nèi)外對甘蔗褐條病菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基多為PDA 培養(yǎng)基[8-9]，但PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)技術(shù)存在病菌生長速度緩慢，產(chǎn)孢時間長，易雜菌污染，不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢數(shù)量少等問題，不但阻礙了甘蔗褐條病病原菌生活史和病害發(fā)生規(guī)律的研究，而且不利于開展對抗病品種進行鑒定篩選等相關(guān)研究工作，已成為制約甘蔗褐條病研究的瓶頸。本研究通過對褐條病菌大量產(chǎn)孢培養(yǎng)方法的研究，發(fā)現(xiàn)取直徑4 mm褐條病菌菌塊，接種于甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，待菌落長至直徑5 cm時，在超凈工作臺中用無菌棉簽將菌落的白色氣生菌絲除去，將病原菌置于24 h 連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)7 d可獲得大量分生孢子。相比PDA 傳統(tǒng)產(chǎn)孢培養(yǎng)方法，本方法的病原菌產(chǎn)孢速率快1 倍以上，產(chǎn)孢量增加10 倍以上，有效地解決了產(chǎn)孢少、產(chǎn)孢慢的技術(shù)難題，且本方法的培養(yǎng)方法步驟簡單，操作方便，污染率低，可以促進甘蔗褐條病菌快速高效產(chǎn)孢，為甘蔗褐條病病原菌生活史、病害發(fā)生規(guī)律、篩選抗甘蔗梢腐病優(yōu)良品種和防治方法等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

甘蔗梢腐病是由多種鐮刀菌引起的一種重要的世界性甘蔗真菌病害。鐮刀菌鑒定指南[10]中通常用康乃馨葉片水瓊脂培養(yǎng)基（CLA）進行大型分生孢子的培養(yǎng)，但是利用該培養(yǎng)基產(chǎn)孢需要近紫外燈光的誘導(dǎo)，而且有些菌產(chǎn)大型分生孢子堆的數(shù)量少，濃度達不到菌種保存和接種濃度的要求。本研究的甘蔗梢腐病產(chǎn)孢方法產(chǎn)孢量多、產(chǎn)孢速度快，有效解決了甘蔗梢腐病病菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)孢少的問題。使用本方法培養(yǎng)3 d 即可得到大量分生孢子，在40 倍顯微鏡下每個視野30～50 個分生孢子，與PDA 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，每個視野分生孢子增加6 倍以上，培養(yǎng)時間節(jié)省4～7 d。本方法培養(yǎng)基產(chǎn)孢量顯著增加，培養(yǎng)周期縮短，有效節(jié)約了人力物力及科研工作者的大量寶貴時間，為甘蔗梢腐病病菌變異動態(tài)、致病力差異、篩選抗病品種及綠色高效殺菌劑等應(yīng)用研究提供了技術(shù)支撐。