殷 艷,韋業(yè)平,麥 虹,張麗瀅
(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣西南寧 530007)
宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,其發(fā)病率位居全球女性惡性腫瘤第四位,是女性癌癥死亡的第四大原因[1]。每年我國(guó)的宮頸癌新發(fā)病例大約有106 000例,我國(guó)與印度的新發(fā)病例約占全世界的1/3,是發(fā)達(dá)國(guó)家的6倍[2]。
大量研究已經(jīng)證實(shí),持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)是宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)及宮頸癌的主要原因。C-myc基因能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖,是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的原癌基因,它參與了多種惡性腫瘤(如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等)的發(fā)生發(fā)展[3],可能是宮頸癌的一種潛在標(biāo)志物。E2F1蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用,在多種腫瘤(如肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌)細(xì)胞呈高表達(dá),表現(xiàn)為促癌基因的作用[4]。目前,關(guān)于E2F1蛋白在宮頸癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程較長(zhǎng),約10-15 a,其處于CIN狀態(tài)的時(shí)間較長(zhǎng),可以有很多機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)病變。目前,發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)有效的篩查方法和廣泛的注射HPV疫苗,已使宮頸癌的發(fā)病率大大降低,但發(fā)展中國(guó)家仍面臨著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此,臨床上開(kāi)展早期篩查、分流管理及適當(dāng)干預(yù)治療至關(guān)重要。
本研究通過(guò)檢測(cè)高危型HPV(16,18,31,33,35,39) DNA、C-myc基因及E2F1蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)情況,探討其與宮頸癌的相關(guān)性及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于篩查宮頸癌的臨床應(yīng)用價(jià)值,旨在進(jìn)一步提高宮頸癌的早期確診率,為患者病情評(píng)估及干預(yù)治療提供參考。
選擇2016年1月至2020年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的活檢及手術(shù)切除的宮頸組織石蠟標(biāo)本100例,包括正常宮頸組織20例為對(duì)照組,患者年齡為35-65歲,平均為(46±12.3)歲;宮頸病變80例為實(shí)驗(yàn)組,包括CIN Ⅰ級(jí)20例,CIN Ⅱ-Ⅲ級(jí)30例,宮頸鱗狀細(xì)胞癌30例,患者年齡為25-66歲,平均為(46±16.5)歲。其中,宮頸鱗狀細(xì)胞癌中臨床分期Ⅰ期20例,Ⅱ期10例;分化程度Ⅰ-Ⅱ級(jí)17例,Ⅲ級(jí)13例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性11例,陽(yáng)性19例。兩組之間的一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)既往無(wú)宮頸物理治療及手術(shù)史;(2)無(wú)其他惡性腫瘤病史;(3)未接受過(guò)放化療及腫瘤藥物治療;(4)所有病理結(jié)果均經(jīng)病理科兩位高級(jí)職稱醫(yī)師審核確定。
生物素標(biāo)記的高危型HPV探針、原位雜交試劑盒購(gòu)自福建泰普生物科學(xué)有限公司;C-myc和E2F1單克隆抗體購(gòu)自廣西卓一生物技術(shù)有限公司。
1.3.1 固態(tài)石蠟標(biāo)本制作
組織標(biāo)本離體后立即進(jìn)行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟,制作石蠟標(biāo)本并常溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 原位雜交技術(shù)檢測(cè)
將組織切成4 μm的薄片,APES處理后烤片,二甲苯脫蠟3次,每次10 min,分別于100%、95%、80%的乙醇溶液脫水3 min,用蒸餾水沖洗3 min,放入盛有雜交增強(qiáng)液的容器里,微波爐高溫處理20 min,自然冷卻至室溫后,用蒸餾水沖洗2 min,擦干。然后再添加探針,蓋上蓋玻片,置于原位雜交儀上95℃變性5 min,37℃培養(yǎng)箱中雜交過(guò)夜。用PBS緩沖液浸片,蓋玻片脫落后,用PBS緩沖液沖洗10 min。滴加適量一抗,放入濕盒中37℃孵育30 min,PBS緩沖液洗滌3次,每次2 min。滴加適量二抗,濕盒中37℃孵育30 min,PBS緩沖液沖洗3次,每次2 min。然后再添加DAB顯色劑,PBS緩沖液終止顯色。自來(lái)水充分沖洗,蘇木精復(fù)染,鹽酸乙醇分化,氨水反藍(lán),乙醇脫水,二甲苯透明,樹(shù)膠封片。結(jié)果判定:高危型HPV DNA原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色點(diǎn)、片狀著色。
1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)
石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化,放入盛有EDTA修復(fù)液的容器里,微波爐高溫處理10 min后進(jìn)行抗原修復(fù)。蒸餾水沖洗3次,每次1 min,放入3% H2O2溶液浸片10 min,蒸餾水沖洗3次,每次1 min,甩干擦凈后,滴加3% BSA,放入濕盒中封閉1 h。滴加一抗,4℃過(guò)夜,TBST沖洗4次,每次30 s。滴加二抗,37℃孵育30 min,TBST沖洗4次,每次30 s。滴加DAB液,蒸餾水充分沖洗,蘇木精復(fù)染,梯度酒精及二甲苯脫水,樹(shù)膠封片。結(jié)果判定:C-myc基因、E2F1蛋白免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞均為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色染色。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc和E2F1的表達(dá)情況如表1所示。HPV DNA在正常宮頸組織中的陽(yáng)性率為5.0%,在CINⅠ、CIN Ⅱ-Ⅲ、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率分別為15.0%、53.3%和80.0%,其陽(yáng)性率呈明顯升高的趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.012,P<0.001)。C-myc基因在正常宮頸組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá);在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ組織中的陽(yáng)性率分別為10.0%和36.7%,且表達(dá)強(qiáng)度增加;在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率為80.0%,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.799,P<0.001)。E2F1蛋白在正常宮頸組織中陽(yáng)性率為5.0%;在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ組織中的陽(yáng)性率分別為25.0%、66.7%;在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率為90.0%,且為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);陽(yáng)性表達(dá)率有明顯增高的趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.530,P<0.001)。病理染色結(jié)果如圖1、圖2所示。
表1 不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc和E2F1的表達(dá)
圖1 CIN Ⅲ、宮頸鱗狀細(xì)胞癌HPV16/18原位雜交著色結(jié)果(40×)
圖2 C-myc、E2F1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(20×)
Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HPV DNA與C-myc基因之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.621,P<0.01),HPV DNA與E2F1蛋白之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.579,P<0.01),C-myc基因與E2F1蛋白之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.555,P<0.01)。
在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)(分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況)的關(guān)系見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,C-myc基因的陽(yáng)性表達(dá)率在分化程度Ⅲ級(jí)明顯高于Ⅰ-Ⅱ級(jí),差異有顯著性(P<0.05),而其余各項(xiàng)差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。
表2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA、C-myc、E2F1與臨床病理關(guān)系
腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,是由多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。流行病學(xué)研究顯示,近年來(lái)我國(guó)宮頸癌發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì),并且存在發(fā)病年齡年輕化的現(xiàn)象,20-30歲女性發(fā)病率上升[5]。宮頸癌最常見(jiàn)的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌,其次為腺癌,其他類型的比較少見(jiàn)。
持續(xù)的高危型HPV感染是CIN和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必需條件之一[6]。研究已發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等高危類型病毒能引起CIN和宮頸癌,所以將這些HPV類型定義為“致癌”病毒類型[7]。高危型HPV感染后整合到宿主細(xì)胞基因組中,導(dǎo)致病毒癌基因E6和E7持續(xù)性表達(dá),并與p53和Rb等抑癌基因結(jié)合使其失活,引發(fā)細(xì)胞異常增殖、凋亡,最終發(fā)生癌變。本研究證實(shí),從正常宮頸組織到CIN各級(jí)病變,最終至宮頸鱗狀細(xì)胞癌,HPV DNA的陽(yáng)性表達(dá)率呈升高趨勢(shì),說(shuō)明高危型HPV感染與CIN以及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展有密切關(guān)系。
C-myc基因位于染色體8q24,是一種重要的核內(nèi)癌基因,對(duì)多種惡性腫瘤均有特異性[8]。正常情況下C-myc基因由于受生長(zhǎng)抑制信號(hào)和有絲分裂原的調(diào)控而處于低表達(dá)水平,從而維持正常的細(xì)胞活動(dòng)。當(dāng)高危型HPV持續(xù)感染宮頸細(xì)胞后,通過(guò)基因整合C-myc發(fā)生擴(kuò)增或特異性重排,導(dǎo)致細(xì)胞中C-myc表達(dá)升高從而促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[9]。有研究證實(shí),從CIN Ⅰ發(fā)展至CIN Ⅲ直至宮頸癌,C-myc基因表達(dá)率明顯升高,并發(fā)現(xiàn)在接受化療后其表達(dá)降低[10]。本研究發(fā)現(xiàn),在正常宮頸組織中C-myc基因無(wú)表達(dá),而在宮頸病變組織中其陽(yáng)性率和表達(dá)程度明顯增加,提示C-myc基因參與了宮頸癌的發(fā)生,其在CIN Ⅰ時(shí)被激活并逐漸積累,持續(xù)存在于整個(gè)癌變過(guò)程中,如C-myc基因異常表達(dá),則患者可能已經(jīng)存在CIN病變甚至是宮頸癌。該研究結(jié)果與Yang等[10]、盧建軍等[11]的研究結(jié)果一致,提示C-myc基因與宮頸病變的進(jìn)展情況密切相關(guān),對(duì)宮頸病變的篩查具有一定的價(jià)值。烏守恒等[12]報(bào)道了C-myc基因的表達(dá)與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究分析了C-myc基因與宮頸鱗狀細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與分化程度有關(guān),隨著分化程度的增加而增加,提示C-myc基因表達(dá)檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)宮頸癌進(jìn)展、觀察病情有指導(dǎo)作用。
E2F1位于染色體20q11,是一種重要的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等生物過(guò)程[13]。研究發(fā)現(xiàn),E2F1在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等組織細(xì)胞中高表達(dá),發(fā)揮促癌基因的作用[14]。HPV感染宮頸細(xì)胞后,HPV E7致癌蛋白和低磷酸化的Rb基因結(jié)合,破壞了Rb/E2F1復(fù)合物,從而使E2F1得以釋放,促進(jìn)組織細(xì)胞進(jìn)入S期而加速細(xì)胞周期進(jìn)程,導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖,促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成[15]。本研究結(jié)果顯示,E2F1的陽(yáng)性表達(dá)率在CIN Ⅱ-Ⅲ及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中明顯升高,提示E2F1過(guò)度表達(dá)能加速細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外,關(guān)于E2F1與腫瘤臨床病理相關(guān)性的研究,其中在乳腺癌中E2F1與分化程度低及預(yù)后差密切相關(guān);外陰癌中E2F1表達(dá)與FIGO分期有關(guān);宮頸癌中E2F1與分期和腫瘤分化程度有關(guān)。本研究也分析了宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中E2F1與病理參數(shù)的關(guān)系,結(jié)果顯示E2F1與分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無(wú)表達(dá)差異,考慮為樣本量較少所致。
宮頸癌的癌前病變期較長(zhǎng),有效篩查及處理是降低宮頸癌發(fā)病率的關(guān)鍵。目前,我國(guó)普遍使用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(Thinprep Cytologic Test,TCT)聯(lián)合HPV的篩查方法,雖然能在早期篩查出宮頸病變,但是對(duì)于病變的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸不能進(jìn)行判斷和預(yù)測(cè)。何志連等[16]研究發(fā)現(xiàn),HPV16/18表達(dá)與C-myc表達(dá)情況呈明顯正相關(guān),推測(cè)C-myc基因是HPV16/18的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn),HPV DNA與C-myc基因、HPV DNA與E2F1蛋白、C-myc基因與E2F1蛋白之間的表達(dá)也存在密切的相關(guān)性,因此可作為宮頸病變?cè)缙诤Y查的生物學(xué)指標(biāo),聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷和評(píng)估具有重要的臨床意義。
本研究表明,HPV DNA、C-myc基因及E2F1蛋白的表達(dá)均隨著宮頸病變的加重而增強(qiáng)。相關(guān)性分析顯示,HPV DNA與C-myc基因、HPV DNA與E2F1蛋白、C-myc基因與E2F1蛋白之間均呈正相關(guān)。C-myc基因在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)隨腫瘤分化程度的降低而增高,提示其與宮頸鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系密切。今后還需進(jìn)一步通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)增加宮頸病變及宮頸癌的早期診斷,對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行分流管理,適時(shí)干預(yù)治療,降低宮頸癌的發(fā)病率,這對(duì)于宮頸病變的診斷及監(jiān)測(cè)具有重要意義。