酶輔助空化處理對(duì)豆渣纖維結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響

沈曉梅，駱兆嬌，侯俊杰，解春艷，王金梅，陳偉漢

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣西梧州冰泉實(shí)業(yè)股份有限公司，廣西梧州543000）（3.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

豆渣（Okara）作為大豆生產(chǎn)加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大且含有豐富的膳食纖維及蛋白質(zhì)[1]，具有預(yù)防糖尿病[2]、肥胖[3]和促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)[4]等多種生理功能，可以作為一種理想的食品功能配料資源[5]。然而，豆渣纖維中不溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF）占膳食纖維的九成以上[6]，會(huì)對(duì)豆渣的感官體驗(yàn)與營(yíng)養(yǎng)吸收造成不利影響，極大限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前很多學(xué)者致力于通過(guò)各種手段對(duì)豆渣纖維進(jìn)行改性處理，促使IDF轉(zhuǎn)化為功能性質(zhì)更優(yōu)的可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fiber，SDF）。物理法、化學(xué)處理、微生物發(fā)酵及酶法改性是常用幾類方法[7]。其中，物理法是通過(guò)各種機(jī)械作用，如高溫、高壓、高剪切力等使大分子的IDF中部分糖苷鍵熔融或斷裂，從而擴(kuò)大其與水的接觸面積，提高水溶性[8]。Liu等[9]采用500 W 15 000 r/min的超聲波和高速剪切組合對(duì)豆渣進(jìn)行改性，豆渣的膨脹力、持水、持油性提高，將其加到面團(tuán)中，改善了面團(tuán)的粘附性和印刷性。Fan等[10]對(duì)豆渣進(jìn)行超聲處理后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲功率密度達(dá)到4 W/mL時(shí)，豆渣纖維破碎成片狀且具有較高的溶脹力、持水力與持油力。以糖酶水解豆渣中的細(xì)胞壁多糖對(duì)促進(jìn)SDF溶出也存在積極效應(yīng)。Yoshida等[11]利用復(fù)合糖酶對(duì)豆渣進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)在最適的酶解條件下SDF的溶出率可提升一倍以上，且持水持油性均得到明顯改善。Pérez-López等[12]在600 MPa高靜水壓下，通過(guò)酶（Ultraflo? L或Viscozyme? L）水解豆渣，高效且最大化的得到具有益生元作用的小分子碳水化合物。

水力空化作為一種新興物理改性技術(shù)，可利用流體流經(jīng)水力結(jié)構(gòu)產(chǎn)生大量空化泡并瞬時(shí)潰滅形成局部高壓、高溫等能量效應(yīng)，從而影響物料的理化功能性質(zhì)[13]。有報(bào)道稱，空化射流可破壞豆渣纖維分子間氫鍵及晶體結(jié)構(gòu)，優(yōu)化處理時(shí)間，SDF含量提升至原來(lái)的5倍，但過(guò)度加工將降低其功能性質(zhì)[14]。Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn)渦流空化使大豆分離蛋白（SPI）粒徑減小，溶解度和表面疏水性增加，β-折疊含量增加，乳化性能得到顯著改善。水力空化具有操作簡(jiǎn)易、能量效率高、加工時(shí)間短、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)。將空化處理與酶法處理結(jié)合可綜合二者操作簡(jiǎn)單、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，預(yù)期可以有效提高豆渣纖維的功能性質(zhì)。本文以脫脂豆渣為原料，采用酶輔助水力空化處理對(duì)豆渣進(jìn)行改性處理，并對(duì)豆渣的纖維組成、持水性、持油性等理化性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以期促進(jìn)豆渣資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕，購(gòu)于山東禹王公司，用于制備豆渣。植物水解酶（酶活力≥1800 U/g），購(gòu)于滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。膳食纖維總量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司?？ㄗ延唾?gòu)于廣州正豐超市。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RW20電動(dòng)攪拌機(jī)，德國(guó)IKA公司；CR22GII高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒公司；A11膠體磨，德國(guó)IKA公司；TW12恒溫水浴鍋，德國(guó)Julabo公司；LABOR-PILOT 2000中試型高剪切分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；水力空化機(jī)，實(shí)驗(yàn)室自組裝；SEM Merlin場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；Vector 70傅里葉變換紅外光譜，德國(guó)BRUKER公司；D8 ADVANCE X射線多晶衍射儀，德國(guó)Brucker公司；C40紫外分光光度計(jì)，德國(guó)IMPLEN公司；TCS SP5流變儀，美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣的制備

取低溫脫脂豆粕粉，以1:8（m/m）固液比加入去離子水，調(diào)pH值至8.0，充分?jǐn)嚢韬箅x心，洗滌沉淀3～5次，重復(fù)3次上述步驟，以盡量多的除去水溶性蛋白，置于烘箱中105 ℃烘干后獲得豆渣，用研磨機(jī)對(duì)烘干后的豆渣進(jìn)行預(yù)粉碎，得到豆渣粗粉（C-0）備用。

1.3.2 豆渣纖維的酶輔助空化處理

稱取一定量粗豆渣粉，配制5%（m/V）的豆渣分散液并充分?jǐn)嚢瑁M(jìn)行如下處理：①采用水力空化機(jī)對(duì)其進(jìn)行空化處理，空化時(shí)間分別為0、5、10、20 min，樣品標(biāo)記為C-0、C-5、C-10、C-20；②利用膠體磨對(duì)豆渣分散液進(jìn)行處理20 min，樣品標(biāo)記為M-20；③調(diào)節(jié)豆渣分散液pH值至4.5，在50 ℃水浴條件下以1%（m/m）的植物水解酶酶解4 h，樣品標(biāo)記為E；④先對(duì)豆渣分散液進(jìn)行4 h酶解處理，隨后利用水力空化機(jī)空化20 min，樣品標(biāo)記為EC；⑤空化處理豆渣分散液20 min后以植物水解酶對(duì)其酶解4 h，樣品標(biāo)記為CE。將經(jīng)上述處理后的豆渣分散液冷凍干燥，即為改性后的樣品。

1.3.3 豆渣持水性、持油性及黏度的表征

持水力（WHC）：參考Yang等[16]的方法并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品（W1）及30 mL去離子水加入到50 mL離心管并充分?jǐn)嚢?，? 000 r/min的速率離心20 min后棄去上清液，準(zhǔn)確稱量沉淀質(zhì)量（W2）并記錄。

持油力（OHC）：準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品（W3）及35 mL葵花籽油加入50 mL離心管并充分?jǐn)嚢?，? 000 r/min的速率離心20 min后棄去上清液，準(zhǔn)確稱量沉淀質(zhì)量（W4）并記錄。

式中：

C水——持水力（WHC），g/g；

C油——持油力（OHC），g/g。

黏度：利用TCS SP5流變儀分析25 ℃下不同樣品的表觀黏度。測(cè)量過(guò)程中使用P60平板，且間隙為1.0 mm。

1.3.4 掃描電鏡（SEM）

將不同處理后的豆渣粉灑在粘有雙面導(dǎo)電膠的金屬樣品盤上，用吸耳球清理浮粉后于真空環(huán)境下進(jìn)行噴金處理，隨后放入電鏡觀察室中于10 kV的加速電壓下進(jìn)行觀察。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

將不同的豆渣樣品與溴化鉀粉末以1:100（m/m）混合均勻并充分研磨，經(jīng)壓片機(jī)壓成透明薄片后利用Nicolet Avatar 360紅外光譜儀測(cè)定400～4 000 cm-1范圍內(nèi)各個(gè)樣品的紅外光譜。測(cè)試數(shù)據(jù)通過(guò)OPUS Viwer軟件分析。

1.3.6 X射線衍射（XRD）

參考王夢(mèng)萍[17]的方法，用D8 Advance衍射器（德國(guó)Bruker公司）測(cè)定不同豆渣纖維的結(jié)晶度。其中掃描角度為2°～50°。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均至少進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），以Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 空化處理對(duì)豆渣纖維結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響

參照GB 5009.3-2016測(cè)得豆渣粗粉C-0的水分、灰分及脂肪含量分別為6.51%、1.42%、2.76%；蛋白質(zhì)含量為15.39%（氮轉(zhuǎn)化系數(shù)為6.25）；豆渣的膳食纖維含量依據(jù)AOAC 991.43進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1?？栈幚砗湍z體磨處理均顯著提高了SDF的含量，隨著空化時(shí)間的延長(zhǎng)，豆渣中總纖維含量保持相對(duì)穩(wěn)定，但SDF含量明顯增加，IDF含量明顯減少。這說(shuō)明空化處理可促進(jìn)IDF向SDF轉(zhuǎn)化。與膠體磨20 min處理樣品相比較，水力空化20 min顯著地提高了豆渣纖維中SDF的含量，這可能與兩種方法的原理不同相關(guān)。膠體磨主要是物理破碎為主，而水力空化過(guò)程中伴隨的局部高壓與高溫效應(yīng)可以導(dǎo)致更多不溶性纖維素發(fā)生斷裂，緊密結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使一些與纖維素結(jié)合的可溶性膳食纖維溶出。

圖1 空化時(shí)間對(duì)豆渣理化性質(zhì)的影響Fig.1 Effect of cavitation time on physicochemical properties of okara

豆渣的水合能力、油結(jié)合能力及黏度對(duì)其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。如圖1a所示，空化處理和膠體磨處理均改善了豆渣纖維的持水和持油性。與膠體磨處理豆渣相比，空化處理豆渣的持水持油改善效果更為明顯。這說(shuō)明相較于單純的均質(zhì)作用，水力空化過(guò)程中空泡潰滅所產(chǎn)生的高溫與高壓更有助于豆渣理化性質(zhì)的改善。豆渣纖維的持水力與持油力均隨空化時(shí)間的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且均在10 min時(shí)達(dá)到峰值（18.43 g/g和7.35 g/g）。這是因?yàn)榭栈母邫C(jī)械強(qiáng)度可顯著降低豆渣纖維的粒徑，使其致密的結(jié)構(gòu)被打開從而暴露出更多親水與親油基團(tuán)。當(dāng)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)（20 min），持續(xù)的高強(qiáng)度作用會(huì)進(jìn)一步破壞豆渣結(jié)構(gòu)至其難以保留更多水分與油脂，這與吳海波等[18]研究結(jié)果相似。

圖1b反映了不同空化處理的豆渣溶液表觀黏度的差異?？傮w而言，所有豆渣懸浮液均表現(xiàn)出明顯的剪切變稀行為。隨著空化時(shí)間的延長(zhǎng)，豆渣溶液的表觀黏度逐漸降低。這一現(xiàn)象歸因于豆渣纖維中小分子水溶性成分含量的提升（表1）。Lopez-Sanchez等[19]曾發(fā)現(xiàn)，更大的粒徑與更多數(shù)量的不溶性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致更高的黏度。較長(zhǎng)時(shí)間的空化處理（20 min）可充分破碎纖維顆粒，顯著減小其粒徑并促進(jìn)IDF向SDF轉(zhuǎn)化，從而降低流動(dòng)阻力。膠體磨處理的豆渣溶液表面黏度明顯高于同等時(shí)間下空化處理的豆渣，這可能與膠體磨處理對(duì)豆渣的破碎強(qiáng)度較空化弱有關(guān)。

圖2 空化時(shí)間對(duì)豆渣SEM形貌的影響Fig.2 Effect of cavitation time on SEM morphology of okara

SEM圖像（圖2）顯示，空化處理明顯改變豆渣纖維的組織結(jié)構(gòu)。經(jīng)空化處理后，豆渣中出現(xiàn)了大量蜂窩狀的片狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出更大的比表面積，且空化10 min時(shí)這種變化尤為顯著（圖2c），隨著空化時(shí)間延長(zhǎng)至20 min時(shí)，片層孔狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步遭到破壞，碎片增多（圖2d）。這一結(jié)構(gòu)變化與可溶性膳食纖維的溶出結(jié)果一致。豆渣的組織結(jié)構(gòu)與其持水、持油性質(zhì)密切相關(guān)，多小孔隔開的片狀結(jié)構(gòu)擁有更大的比表面積，豆渣纖維暴露出更多的羥基和親油基團(tuán)，使其持水、持油性質(zhì)明顯改善，當(dāng)空化時(shí)間延長(zhǎng)，這種結(jié)構(gòu)遭到破壞，豆渣纖維顆粒破碎程度增加，其持水、持油能力相應(yīng)降低（圖1a），表觀黏度也變小（圖1b）。這與Li等[20]采用蒸汽爆破處理豆渣時(shí)，豆渣表面松散的片狀結(jié)構(gòu)被破壞成小碎塊，導(dǎo)致其持水性、持油性降低的研究結(jié)果相似。豆渣纖維膠體磨處理也能使豆渣結(jié)構(gòu)崩解，但其結(jié)構(gòu)解離程度稍遜于同等時(shí)間處理下的空化樣品。

圖3 空化時(shí)間對(duì)豆渣傅里葉紅外光譜與X射線衍射圖譜的影響Fig.3 Effect of cavitation time on Fourier transform infrared spectroscopy and X-ray diffraction spectra of okara in different treatment

對(duì)豆渣進(jìn)行500～4 000 cm-1范圍內(nèi)的傅里葉紅外光譜掃描，如圖3a所示。豆渣在3 200～3 700 cm-1范圍內(nèi)及2 928 cm-1附近的紅外吸收峰強(qiáng)度隨空化時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增大，表明空化處理可加強(qiáng)豆渣分子間氫鍵的相互作用。這可能與較長(zhǎng)時(shí)間的空化處理釋放足夠的能量以促進(jìn)豆渣結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多基團(tuán)有關(guān)。1 050 cm-1及889 cm-1處糖苷鍵的伸縮振動(dòng)增強(qiáng)也證明了這一點(diǎn)。較高空化時(shí)間下豆渣酰胺Ⅰ帶處的紅外吸收也明顯增強(qiáng)，說(shuō)明持續(xù)的空化作用有助于豆渣內(nèi)部殘余蛋白質(zhì)的釋放?？栈幚鞦T-IR圖譜與膠體磨差別不大。

對(duì)空化不同時(shí)間豆渣的X射線衍射圖譜進(jìn)行分析可明確空化處理對(duì)纖維晶體結(jié)構(gòu)及結(jié)晶度的影響。由圖3b可知，未處理豆渣的XRD曲線在2θ為21.4°和38.2°處顯示明顯的衍射峰，是纖維素Ⅰ型的特征衍射峰[21]。豆渣經(jīng)空化處理后，在2θ為21.4°處的衍射峰明顯減弱，在2θ為38.2°處的衍射峰甚至消失不見，表明豆渣中的纖維素結(jié)晶度降低。Qi等[22]在高能濕法介質(zhì)磨處理豆渣不溶性膳食纖維的研究中也觀察到纖維素結(jié)晶度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低的現(xiàn)象。

2.2 酶法輔助空化處理對(duì)豆渣纖維結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響

表2 不同處理對(duì)豆渣膳食纖維含量的影響（%）Table 2 Effect of different treatment on dietary fiber content of okara (%)

有研究稱利用復(fù)合糖酶水解豆渣細(xì)胞壁多糖可增加其可溶性成分并提高功能性質(zhì)[23]。本研究以植物水解酶酶解輔助水力空化技術(shù)對(duì)豆渣進(jìn)行處理，并測(cè)定了其纖維組成（表2）。植物水解酶酶解4 h可將SDF的含量提升至8.13%，較未處理的豆渣提升了2.83倍。這歸因于植物水解酶主要以纖維素酶、果膠酶與木聚糖酶復(fù)配而成，這些酶可水解豆渣纖維中的糖苷鍵，使其降解成分子量更小的片段，降低分子聚合度，釋放SDF。將空化與酶解兩種手段聯(lián)合用于處理豆渣，可進(jìn)一步提升SDF含量，但酶解處理的先后順序?qū)DF溶出效果有較大影響。先空化20 min后酶解對(duì)SDF含量的提升效果并不顯著，而先酶解后空化的豆渣中SDF含量可提升至12.52%，明顯高于前者。這可能是因?yàn)橄冗M(jìn)行酶解處理能有效降解豆渣細(xì)胞壁成分，形成較為通透松散的結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上再對(duì)其進(jìn)行空化處理更有利于可溶性成分的釋放。

圖4反映了不同處理對(duì)豆渣理化性質(zhì)的影響。單純酶解豆渣的持水力與持油力較未處理豆渣均有明顯提升，黏度明顯下降，說(shuō)明植物水解酶具有較好的豆渣改性能力。酶解與空化處理的先后順序?qū)Χ乖睦砘再|(zhì)也存在一定程度的影響，先酶解后空化的豆渣（EC）持水力和持油力不及先空化后酶解的樣品（CE）。酶解處理后豆渣的表觀黏度明顯降低，這與植物水解酶降低了豆渣纖維的聚合度，從而減小其運(yùn)動(dòng)阻力有關(guān)。EC的溶液表觀黏度較CE低，這可能歸因于EC中小分子可溶性成分含量更高，溶液流動(dòng)阻力較小。

圖4 不同處理對(duì)豆渣理化性質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different treatments on physicochemical properties of okara

圖5為不同處理下豆渣的微觀形貌圖。以植物水解酶酶解的豆渣呈現(xiàn)表面光滑的塊狀結(jié)構(gòu)，且無(wú)明顯碎片。酶解與空化聯(lián)合處理的豆渣較單一處理的樣品顯示出一些更小、更碎的片狀結(jié)構(gòu)，表明聯(lián)合處理可使豆渣發(fā)生劇烈撕裂，減小纖維尺度。酶解與空化的先后順序?qū)Χ乖w維形貌亦有較強(qiáng)的影響，CE的碎片狀結(jié)構(gòu)之間的連接比EC多，表現(xiàn)為CE的持水、持油能力及表觀黏度都比EC高，這與圖4的結(jié)果可以互證。

圖5 酶及空化處理對(duì)豆渣SEM形貌的影響Fig.5 Effect of enzyme and cavitation treatment on SEM morphology of okara

圖6 不同處理下豆渣的傅里葉紅外光譜與X射線衍射圖譜。Fig.6 Fourier transform infrared spectroscopy and X-ray diffraction spectra of okara in different treatment

由圖6a可知，植物水解酶酶解后豆渣的FT-IR圖譜與未處理豆渣相似，這可能與酶解破壞豆渣表面結(jié)構(gòu)后使內(nèi)部基團(tuán)再次暴露有關(guān)?？栈c酶法聯(lián)合處理的豆渣中氫鍵及糖苷鍵的伸縮振動(dòng)明顯增強(qiáng)，但先酶解后空化的豆渣中各紅外吸收峰較先空化后酶解的樣品低。圖6b反映了不同處理手段對(duì)豆渣晶型及結(jié)晶度的影響，酶解、空化以及二者聯(lián)合處理均能有效減弱21.4°及38.2°處纖維素的特征峰，且處理后豆渣的結(jié)晶度下降明顯，這說(shuō)明以上處理方法均能對(duì)豆渣纖維結(jié)構(gòu)造成破壞作用。

3 結(jié)論

水力空化技術(shù)通過(guò)空泡潰滅釋放的熱能與高機(jī)械強(qiáng)度可使豆渣結(jié)構(gòu)更為松散，暴露出更多親水、親油基團(tuán)，顯著提升其持水性和持油性并降低溶液黏度。但隨著水力空化時(shí)間的不斷延長(zhǎng)（＞10 min），豆渣的結(jié)構(gòu)可能被進(jìn)一步破壞而導(dǎo)致其持水性和持油性下降。以纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶復(fù)配的植物水解酶能專一性切斷豆渣纖維中的糖苷鍵，從而釋放出更多SDF，降低豆渣體系黏度。酶法輔助空化處理可在空化和酶解單一處理的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升SDF含量，改善豆渣的持水持油能力，并顯著降低表觀黏度，這可能有利于豆渣應(yīng)用于液態(tài)食品。