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    苦蕎中蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制能力

    2022-10-09 01:57:22周一鳴馬思佳蔣晴怡周小理李云龍
    食品科學(xué) 2022年18期
    關(guān)鍵詞:消化酶苦蕎蘆丁

    周一鳴,馬思佳,蔣晴怡,周小理,2,*,李云龍

    (1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418;2.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 美麗中國(guó)與生態(tài)文明研究院上海高校智庫(kù),上海 201418;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院,山西 太原 030031)

    隨著人們生活質(zhì)量的改善和醫(yī)療水平的提高,全球平均健康預(yù)期壽命穩(wěn)定增長(zhǎng)。然而,糖尿病等代謝類疾病發(fā)生率出現(xiàn)驚人的增長(zhǎng),已成為許多國(guó)家的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前,糖尿病是僅次于腫瘤和心腦血管病威脅人類健康的第3大疾病。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)表明,截至2019年全世界患有糖尿病的成年人總數(shù)已達(dá)4.63億,中國(guó)糖尿病患者人數(shù)已達(dá)1.1億。糖尿病的主要危害在于糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡。管理糖尿病的主要策略是減少糖的攝入,抑制碳水化合物的水解,主要通過(guò)抑制碳水化合物水解過(guò)程中起關(guān)鍵作用的兩種淀粉消化酶α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶實(shí)現(xiàn)。

    目前,阿卡波糖、二甲雙胍和米格列醇等藥物已經(jīng)在臨床被用于抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性,以治療II型糖尿病。但是使用這些藥物往往會(huì)對(duì)腸胃產(chǎn)生很大的副作用,包括惡心、脹氣、腹瀉、腹痛和腸胃氣脹,其主要原因是未被消化的碳水化合物在腸道菌群的作用下異常發(fā)酵而引起。近年來(lái),隨著人們?cè)絹?lái)越重視天然和健康食品,一些天然來(lái)源的植物或提取物已被研究發(fā)現(xiàn)具有抑制消化酶的作用,并且毒性較低,尤其是聯(lián)合使用兩種或兩種以上天然化合物可以起到協(xié)同治療的效果,減少劑量和毒性,同時(shí)能夠減少耐藥性的誘導(dǎo)。Wu Xiaqing等的研究發(fā)現(xiàn)表兒茶素沒(méi)食子酸酯與阿卡波糖或表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯聯(lián)合對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)為拮抗作用,對(duì)α-葡萄糖苷酶則表現(xiàn)為協(xié)同作用。

    苦蕎因其高營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值已顯示出良好的市場(chǎng)潛力。研究發(fā)現(xiàn),苦蕎富含淀粉,尤其是抗性淀粉,可以作為糖尿病患者的理想食物。同時(shí),苦蕎中含有較豐富的黃酮類化合物,包括蘆丁、槲皮素、山柰酚等成分,是降血糖的主要功能因子,其中蘆丁是苦蕎黃酮的主要成分,占黃酮類化合物的70%以上。已有研究指出,苦蕎黃酮的濃度與抑制淀粉消化酶的效率呈正相關(guān)。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)苦蕎總黃酮對(duì)淀粉消化酶的抑制效果強(qiáng)于苦蕎水溶性提取物和苦蕎醇溶性提取物,說(shuō)明苦蕎黃酮的降血糖功效往往是多種成分共同發(fā)揮的作用。

    苦蕎中黃酮對(duì)淀粉消化酶抑制作用的研究往往局限于單獨(dú)抑制,而缺乏對(duì)聯(lián)合抑制作用的探討,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬苦蕎淀粉體外消化體系,探討苦蕎中的主要黃酮(蘆丁和槲皮素)對(duì)淀粉消化酶的單獨(dú)抑制效果和機(jī)制,以及同時(shí)存在時(shí)對(duì)淀粉消化酶活性的抑制作用,為苦蕎產(chǎn)品的深加工提供一定理論基礎(chǔ),以期為調(diào)控苦蕎的功能性,最大化苦蕎的降血糖效果指引方向。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    蘆?。兌取?8%)、槲皮素(純度≥98%)、阿卡波糖、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(純度≥98%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;豬胰腺α-淀粉酶(酶活力2 000 U/g) 美國(guó)Adamas-beta公司;α-葡萄糖苷酶(酶活力100 000 U/mL) 上海源葉生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司;苦蕎淀粉由實(shí)驗(yàn)室自制。

    1.2 儀器與設(shè)備

    M200 PRO酶標(biāo)儀 奧地利帝肯公司;RF-5301 PC熒光分光光度計(jì) 日本島津株式會(huì)社;PURELAB Classic超純水機(jī) 英國(guó)ELGA公司;SHZ-B水浴恒溫振動(dòng)搖床中國(guó)上海博訊公司。

    1.3 方法

    1.3.1 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的單獨(dú)抑制實(shí)驗(yàn)

    對(duì)α-淀粉酶的抑制實(shí)驗(yàn)參照王靜等的方法。將60 μL不同質(zhì)量濃度(0~1 mg/mL)蘆丁或槲皮素和60 μL 2 U/mL α-淀粉酶混合,37 ℃預(yù)孵育10 min。添加2.5 mL 20 mg/mL Tris緩沖鹽溶液、0.4 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.9)和0.98 mL超純水,37 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應(yīng)3 min。最后加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸,在沸水浴中加熱5 min后終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液冷卻至室溫后,稀釋至25 mL,在540 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

    對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hao Chunchao等的方法。將100 μL不同質(zhì)量濃度蘆丁或槲皮素和100 μL 2 U/mL α-淀粉酶混合,37 ℃預(yù)孵育10 min。添加250 μL 3 mmol/L對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、1 mL磷酸鈉緩沖液和0.98 mL超純水,37 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應(yīng)10 min。最后,加入NaCO溶液(2 mL、1 mol/L)停止反應(yīng),在405 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

    設(shè)置僅添加酶為空白組,抑制劑和酶都不添加為空白對(duì)照組,添加抑制劑和酶為樣品組,僅添加抑制劑為樣品對(duì)照組。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率:

    1.3.2 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

    參照陳雨涔等的方法,固定底物質(zhì)量濃度(2 g/mL、2.5 mL),測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)和槲皮素(0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL)存在時(shí),對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨α-淀粉酶活力的變化,判斷抑制劑的可逆性。固定底物濃度(3 mmol/L、250 μL),測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)和槲皮素(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)存在時(shí),對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨α-葡萄糖苷酶活力的變化,判斷抑制劑的可逆性。

    固定α-淀粉酶(2 U/mL、60 μL)活力,測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)和槲皮素(0、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL)存在時(shí),對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨底物質(zhì)量濃度的變化。固定α-葡萄糖苷酶(2 U/mL、100 μL)活力,測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆?。?、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)和槲皮素(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)存在時(shí),對(duì)應(yīng)體系的反應(yīng)速率隨底物質(zhì)量濃度的變化。

    進(jìn)一步以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)初速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制Lineweaver-Burk曲線圖,根據(jù)所得直線的相交情況,確定蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

    式(2)~(5)中:v為存在或不存在蘆丁和槲皮素時(shí)的酶促反應(yīng)速率;v為最大酶反應(yīng)速率;c為苦蕎淀粉和對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷濃度;c為蘆丁和槲皮素質(zhì)量濃度;K為米氏常數(shù);K為抑制劑與酶結(jié)合的平衡常數(shù);K為抑制劑與酶-底物復(fù)合物結(jié)合的平衡常數(shù)。

    1.3.3 淀粉消化酶的熒光猝滅分析

    參考梁宗瑤等的方法,在3 種溫度(298、304、310 K)下用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光變化,加入不同濃度的蘆丁或槲皮素(0~64 μmol/L)孵育5 min后,繼續(xù)進(jìn)行測(cè)量。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm;發(fā)射波長(zhǎng)300~500 nm;激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均5.0 nm。通過(guò)Stern-Vlomer方程可以判斷蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅機(jī)理,如下:

    式(6)~(7)中:F和F分別為α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶在不存在或存在蘆丁和槲皮素時(shí)的熒光強(qiáng)度;c為蘆丁和槲皮素的濃度;τ為熒光團(tuán)的平均熒光壽命;K、K和K分別為猝滅速率常數(shù)、猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

    蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的主要作用力類型可以通過(guò)Van’t-Hoff方程進(jìn)行判斷,如下:

    式(8)~(9)中:T為溫度;R為氣體常數(shù);ΔG為自由能變化;ΔH為焓變;ΔS為熵變。

    1.3.4 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的聯(lián)合抑制實(shí)驗(yàn)

    通過(guò)蘆丁和槲皮素單獨(dú)抑制時(shí)的抑制能力曲線計(jì)算出對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度(IC)值。在此基礎(chǔ)上結(jié)合苦蕎加工過(guò)程中蘆丁和槲皮素的變化范圍,將蘆丁與槲皮素按照不同濃度比混合,參考1.3.1節(jié)中酶活性測(cè)定方法,進(jìn)行聯(lián)合抑制實(shí)驗(yàn),計(jì)算蘆丁與槲皮素聯(lián)合對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。為了評(píng)價(jià)蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用的抑制作用,判斷聯(lián)合作用的效果,利用等效線圖解法和Chou-Talalay藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)進(jìn)行評(píng)價(jià)。CI計(jì)算公式如下:

    式中:D、D分別為組合系統(tǒng)中產(chǎn)生一定抑制水平蘆丁和槲皮素的劑量;Dx、Dx分別為單獨(dú)添加的導(dǎo)致相同抑制水平蘆丁和槲皮素的劑量。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的單獨(dú)抑制能力

    如圖1所示,蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶都表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用。其中,阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照的酶抑制效果最強(qiáng),對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC值分別為0.047 mg/mL和0.03 mg/mL。但阿卡波糖對(duì)淀粉消化酶的過(guò)度抑制可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸內(nèi)未被消化的淀粉發(fā)生異常發(fā)酵,從而產(chǎn)生胃腸道功能紊亂;而蘆丁和槲皮素相對(duì)溫和的抑制活性,能有效緩解胃腸道不適。由圖1A可知,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的IC值分別為0.36 mg/mL和0.22 mg/mL;由圖1B可知,蘆丁和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC值分別為1.3 mg/mL和0.362 mg/mL。槲皮素比蘆丁具有更強(qiáng)的抑制能力,是由于槲皮素C環(huán)上的羥基被一個(gè)糖基取代變?yōu)樘J丁,羥自由基轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔赡軙?huì)發(fā)生空間位阻,削弱蘆丁與酶的結(jié)合作用,從而降低蘆丁的抑制能力。

    圖1 蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制曲線Fig. 1 Inhibitory effects of rutin and quercetin on α-amylase (A) and α-glucosidase (B)

    此外,由圖1可知,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的抑制效果更強(qiáng),分別是對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力的3.6 倍和1.6 倍,這可能是由于蘆丁和槲皮素B環(huán)上的羥基有利于與α-淀粉酶的活性位點(diǎn)結(jié)合。

    2.2 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

    由圖2可知,不同質(zhì)量濃度的蘆丁和槲皮素都能得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線,且斜率隨著質(zhì)量濃度的增加而減小。由此可知,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都屬于可逆性抑制作用。

    圖2 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的抑制可逆性Fig. 2 Reversible inhibitory effects of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

    如圖3A和C所示,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶抑制的雙倒數(shù)曲線,所有直線與縱軸相交,隨著蘆丁和槲皮素質(zhì)量濃度的增加,K值不斷增加而v值保持不變。因此蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制,通過(guò)與α-淀粉酶的活性中心結(jié)合,占據(jù)底物的結(jié)合位點(diǎn),從而抑制底物的水解。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制公式可以計(jì)算出蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的K值分別為806.29、793.92 μg/mL,說(shuō)明槲皮素與α-淀粉酶的結(jié)合更牢固,具有更強(qiáng)的抑制效果,與2.1節(jié)中槲皮素對(duì)α-淀粉酶的抑制能力強(qiáng)于蘆丁的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

    如圖3B所示,所有直線都相交于第3象限,K值和v同時(shí)減小,表明蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶屬于非競(jìng)爭(zhēng)性和反競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制,其中,K值為9.61 μmol/L,K值為3.38 μmol/L,說(shuō)明蘆丁更傾向于與酶-底物復(fù)合物結(jié)合。如圖3D所示,所有直線都相交于第2象限,K值逐漸升高,同時(shí)v逐漸降低,表明槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制,K值為3.72 μmol/L,K值為9.74 μmol/L,說(shuō)明槲皮素更傾向于與游離的α-葡萄糖苷酶結(jié)合。

    圖3 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的雙倒數(shù)圖Fig. 3 Double-reciprocal plots of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

    2.3 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的熒光光譜分析

    由圖4可知,當(dāng)測(cè)試溫度298 K、激發(fā)波長(zhǎng)280 nm時(shí),α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均在340 nm波長(zhǎng)附近有最大發(fā)射峰(λ)。當(dāng)反應(yīng)體系中加入不同濃度的蘆丁和槲皮素,兩種酶的熒光強(qiáng)度都展現(xiàn)出劑量依賴性的猝滅,且λ發(fā)生不同程度的移動(dòng)。如圖4A和B所示,隨著蘆丁濃度的增加,α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的λ分別從340 nm移動(dòng)到335 nm和332 nm;如圖4C和D所示,隨著槲皮素濃度的增加,α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的λ分別從342 nm和340 nm移動(dòng)至338 nm。這種現(xiàn)象表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用,導(dǎo)致氨基酸殘基逐漸暴露在水溶液中,所處環(huán)境極性降低。

    圖4 蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶熒光光譜圖Fig. 4 Fluorescence spectra of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

    2.4 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的結(jié)合性質(zhì)分析

    由圖5可知,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer曲線均具有良好的線性關(guān)系。由表1可知,隨著溫度的升高,蘆丁對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值分別降低了2.58×10L/mol和1.97×10L/mol,槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值分別降低了1.60×10L/mol和2.12×10L/mol;K值均隨著溫度的升高而降低,且K值為10和10數(shù)量級(jí),遠(yuǎn)大于生物大分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)2.0×10L/(mol·s),說(shuō)明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均通過(guò)形成復(fù)合物的方式發(fā)生靜態(tài)猝滅。

    圖5 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的Stern-Volmer曲線Fig. 5 Stern-Volmer curves of rutin and quercetin against starch-digesting enzymes

    由圖6可知,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖均具有良好的線性關(guān)系,利用擬合直線的斜率和截距,并結(jié)合靜態(tài)猝滅公式,由此可以計(jì)算得到K值和n。如表1所示,槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的K值均高于蘆丁,說(shuō)明槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合力更強(qiáng);蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的K值高于α-葡萄糖苷酶,說(shuō)明蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶具有更強(qiáng)的結(jié)合力。此外,n值近似于1,表明蘆丁和槲皮素在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶上只存在一個(gè)(或一類)結(jié)合位點(diǎn)。

    圖6 蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖Fig. 6 Double logarithm plots of rutin and quercetin with starch-digesting enzymes

    通過(guò)Van’t-Hoff方程計(jì)算出ΔH、ΔS及ΔG的變化,可以判斷蘆丁和槲皮素與淀粉消化酶之間的相互作用力。如表1所示,ΔG均為負(fù)值,表明蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合是一種自發(fā)的過(guò)程。蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶反應(yīng)時(shí),ΔH均為負(fù)值,ΔS均為正值,表明這種結(jié)合是熵驅(qū)動(dòng)的放熱過(guò)程,疏水相互作用力和氫鍵是蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶復(fù)合物穩(wěn)定的主要驅(qū)動(dòng)力。蘆丁和槲皮素與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)時(shí),ΔH和ΔS均為負(fù)值,表明主要驅(qū)動(dòng)力是氫鍵。

    表1 蘆丁或槲皮素與α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶相互作用及熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters for interaction between rutin or quercetin and α-amylase or α-glucosidase

    2.5 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的聯(lián)合抑制作用

    由2.1節(jié)的結(jié)果(圖1)可知,蘆丁和槲皮素對(duì)于α-淀粉酶的IC比為1.64∶1,蘆丁和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC比為3.6∶1。已有研究發(fā)現(xiàn)苦蕎中蘆丁含量是槲皮素的7 倍,但在加工存儲(chǔ)過(guò)程中約80%的蘆丁會(huì)水解成槲皮素,所以槲皮素含量通常是蘆丁的5 倍。因此,分別以7∶1、1.64∶1和1.64∶8.2,作為蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用抑制α-淀粉酶的濃度比,以7∶1、3.6∶1和3.6∶18作為蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用抑制α-葡萄糖苷酶的濃度比。

    圖7 蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用對(duì)α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制能力Fig. 7 Combined inhibition of rutin and quercetin on α-amylase (A)and α-glucosidase (B)

    如圖7所示,蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制效果。在相同質(zhì)量濃度下,蘆丁和槲皮素聯(lián)合作用優(yōu)于單獨(dú)抑制的效果,且抑制率隨著二者聯(lián)合質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高。二者濃度比為1.64∶8.2時(shí)對(duì)α-淀粉酶抑制能力最強(qiáng),IC值為0.055 mg/mL;二者濃度比為3.6∶18時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力最強(qiáng),IC值為0.091 mg/mL。結(jié)果表明,蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用時(shí)均能夠提高對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果,且槲皮素較多時(shí),抑制作用更強(qiáng)。

    2.6 蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶聯(lián)合抑制作用的評(píng)價(jià)

    圖8 蘆丁和槲皮素聯(lián)合抑制α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的IC50等效線圖Fig. 8 IC50 isobolograms for inhibition of α-amylase (A) and α-glucosidase (B) by combined use of rutin and quercetin

    由圖8A可知,3 種濃度比下的劑量對(duì)均位于等效線的下方,CI值分別為0.20、0.22和0.24,均小于1,表明蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用對(duì)α-淀粉酶表現(xiàn)出協(xié)同抑制的作用。其中,蘆丁和槲皮素濃度比為7∶1時(shí)CI值最小,具有更好地協(xié)同抑制效果,這可能是由于α-淀粉酶上有多個(gè)活性位點(diǎn),蘆丁和槲皮素能夠與α-淀粉酶的不同氨基酸殘基發(fā)生特異性結(jié)合,聯(lián)合使用時(shí)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),增加了黃酮-酶復(fù)合物的穩(wěn)定性。

    由圖8B可知,3 種濃度比下的劑量對(duì)均位于等效線的下方,CI值分別為0.41、0.36和0.22,均小于1。表明蘆丁和槲皮素聯(lián)合使用時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出協(xié)同抑制的作用。其中,蘆丁和槲皮素濃度比為3.6∶18時(shí)CI值最小,具有更好的協(xié)同抑制效果,這可能是由于蘆丁和槲皮素都能夠非競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶活性,與α-葡萄糖苷酶的非競(jìng)爭(zhēng)性位點(diǎn)結(jié)合,增強(qiáng)了協(xié)同抑制作用。此外,由2.4節(jié)的結(jié)果可知,槲皮素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合力更強(qiáng),因此槲皮素占比較多時(shí)協(xié)同抑制效果更好。

    3 結(jié) 論

    通過(guò)探究苦蕎中黃酮的主要成分蘆丁和槲皮素單獨(dú)使用和聯(lián)合使用的抑制效果,結(jié)合抑制動(dòng)力學(xué)、熒光光譜法,更加精準(zhǔn)和全面地分析苦蕎中蘆丁和槲皮素對(duì)淀粉消化酶的影響。主要研究結(jié)果表明,蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有劑量依賴性的抑制,且對(duì)兩種淀粉消化酶的抑制效果皆為槲皮素優(yōu)于蘆丁。蘆丁和槲皮素對(duì)α-淀粉酶的IC值分別為0.36 mg/mL和0.22 mg/mL,對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC值分別為1.30 mg/mL和0.362 mg/mL。二者對(duì)α-淀粉酶的抑制效果強(qiáng)于α-葡萄糖苷酶。進(jìn)一步判斷抑制機(jī)理可知,蘆丁和槲皮素與α-淀粉酶以疏水相互作用力和氫鍵結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶的活性,且槲皮素與α-淀粉酶的結(jié)合能力更強(qiáng),能起到更好的抑制效果;對(duì)α-葡萄糖苷酶均為通過(guò)氫鍵結(jié)合的混合型抑制。同時(shí),二者與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合只存在一個(gè)(或一類)作用位點(diǎn)。將蘆丁和槲皮素按照不同比例聯(lián)合使用可以增強(qiáng)兩者單用時(shí)的抑制能力,并且對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都具有協(xié)同抑制的作用,當(dāng)二者濃度比為7∶1和3.6∶18時(shí),對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的CI值分別達(dá)到0.20和0.22,具有最佳的協(xié)同抑制效果。

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