核酸適配體可視化檢測養(yǎng)殖水樣品中的孔雀石綠

李 娜，袁 聰，張秋雙，王小艷

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450011)

孔雀石綠是一種具有毒性的三苯甲烷類染料，能夠有效地抑制和殺滅真菌、寄生蟲和細(xì)菌[1,2]?？兹甘G為翠綠色、帶強(qiáng)烈光澤的固態(tài)結(jié)晶物，其在水溶液中可以清晰地顯示淡淡的藍(lán)綠色[3-5]?？兹甘G毒性高[6]，孔雀石綠中毒導(dǎo)致魚類的腮、皮膚表面和消化道發(fā)炎，并且能夠阻止腸道酶的分泌[7-9]，還可以致畸、致癌、致突變，被歸入二類致癌物[10-14]。

目前，國內(nèi)外檢測孔雀石綠的方法主要有分光光度法[15-17]、色譜法[18,19]、電化學(xué)法[20,21]、酶聯(lián)免疫吸附法[22,23]、生物傳感器法[24]等。雖然這些方法可以有效地測定樣品中孔雀石綠含量，但這些方法前處理及操作過程復(fù)雜，需用專門的儀器設(shè)備，對(duì)人員技術(shù)要求高，測定成本高，從而限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。

核酸適配體和納米金之間具有一定的親和力，能將納米金吸附到其表面從而改變納米金的聚集狀態(tài)，進(jìn)而產(chǎn)生顏色反應(yīng)[25]，本試驗(yàn)基于納米金顆粒顏色變化機(jī)理，選用核酸適配體作為生物識(shí)別元件，構(gòu)建一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的可視化快速檢測孔雀石綠的方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

孔雀石綠購自國康生物科技有限公司。檸檬酸鈉購自西安拉維亞生物科技有限公司。氯金酸購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。核酸適配體引物序列為5′-ATTGGCACTCCACGCATAGGGACGCGAATAGCGGACCYATGTGTGGTGTGTTACGGCGAGCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)購自上海元析儀器有限公司；酶標(biāo)板恒溫振蕩器購自海門市其林貝爾儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器和集熱式恒溫加熱磁力攪拌器購自上海重逢科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平(AE224)購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；旋渦混勻器(VORTEX 06)購自上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司；超純水儀購自深圳市萊克智能精密儀器有限公司；微量高速冷凍離心機(jī)購自四川蜀科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米金的合成

納米金的合成材料是1%氯金酸和1%檸檬酸鈉溶液，納米金的合成按照Lee 等[25]的方法進(jìn)行。

1.3.2 孔雀石綠的檢測

首先配置不同濃度的孔雀石綠溶液，將20 μL的1 μmol/L DNA適配體和10 μL 的2 μmol/L MG溶液依次加入到96孔板中，充分振蕩混合10 min，然后加入50 μL的 5 μmol/L納米金溶液，反應(yīng)5 min，再加入3 μL的1.5 mol/L NaCl溶液，繼續(xù)振蕩10 min，然后用紫外分光光度計(jì)分別測650 nm和520 nm處的吸光度，吸光度比值與空白對(duì)照比值相減得吸光度差值(A650/A520)。繪制吸光度差值與孔雀石綠之間的相關(guān)性曲線。

1.3.3 特異性

選擇陽性對(duì)照物鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、土霉素、四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶進(jìn)行檢測方法的選擇性研究。體系中孔雀石綠和其他藥物的濃度均為0.1 μmol/L。設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照孔。測得650 nm和520 nm處的吸光度，記錄溶液的顏色，吸光度比值與空白對(duì)照比值相減后得吸光度差值(A650/A520)，記錄吸光度差值的變化并繪制成圖。

1.3.4 樣品的加標(biāo)回收

取養(yǎng)殖水樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾以去除雜質(zhì)，然后取1 mL水樣加入不同濃度的孔雀石綠(0.1、0.3和0.5 μmol/L)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 可視化檢測孔雀石綠的原理

表面帶有檸檬酸的納米金顆粒之間相互排斥，顆粒分散在溶液中。當(dāng)溶液體系中只有納米金和適配體時(shí)，適配體會(huì)包含在納米金外圍而起到保護(hù)納米金的作用，此時(shí)向溶液中加入鹽溶液，由于適配體的保護(hù)作用，溶液的顏色不變，仍為紅色。當(dāng)加入靶標(biāo)后，適配體與靶標(biāo)結(jié)合，使得納米金裸露而與鹽溶液發(fā)生反應(yīng)，此時(shí)納米金顆粒在高濃度的鹽環(huán)境中均勻分散，溶液的顏色向藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變。

2.2 紫外吸收光譜表征

采用紫外分光光度計(jì)快速檢測孔雀石綠方法的可行性(見圖1)。當(dāng)體系中只有納米金時(shí)，溶液呈現(xiàn)酒紅色(曲線a)；當(dāng)溶液中加入鹽溶液時(shí)，鹽會(huì)與納米金發(fā)生反應(yīng)而溶液呈現(xiàn)出淺藍(lán)色(曲線b)；同時(shí)存在納米金和適配體時(shí)，適配體會(huì)與納米金結(jié)合，起到保護(hù)納米金的作用，溶液不變色(曲線c)；向溶液中加入一定量的鹽時(shí)，由于鹽的作用會(huì)使得適配體不再完全保護(hù)納米金(曲線d)；而當(dāng)整個(gè)體系加入目標(biāo)物孔雀石綠后，會(huì)使得鹽脫離出來繼而和納米金反應(yīng)，使得溶液變成淺藍(lán)色(曲線e)，吸收峰發(fā)生偏移。曲線f是只有目標(biāo)物時(shí)的吸光度，當(dāng)只有孔雀石綠時(shí)，溶液體系吸光度趨近于0，驗(yàn)證了目標(biāo)物對(duì)整個(gè)體系沒有影響。

圖1 不同條件下反應(yīng)溶液的吸收光圖譜

2.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 體積比例

考察了不同體積(25、50、75和100 μL)納米金溶液的吸光度值變化和顏色變化(圖2)。結(jié)果表明，納米金溶液體積為25 μL時(shí)，溶液接近無色，當(dāng)納米金溶液為50 μL時(shí)，溶液呈淺藍(lán)色，而當(dāng)納米金溶液體積超過75 μL時(shí)，體系呈現(xiàn)出納米金的紅色，整個(gè)體系基本沒有變化，說明納米金的用量過多。納米金溶液體積選擇50 μL為宜。

圖2 納米金溶液體積對(duì)吸光度值差的影響

2.3.2 氯化鈉體積的優(yōu)化

氯化鈉的體積影響納米金顆粒的聚集?？疾炝瞬煌w積(1、2、3、4、5 μL)氯化鈉溶液的吸光度值變化和顏色變化(圖3)，結(jié)果顯示，加入的氯化鈉越多，納米金顆粒變成藍(lán)紫色越容易。當(dāng)加入氯化鈉的量少于3 μL時(shí)，溶液顏色會(huì)由酒紅色變成淺藍(lán)色。但當(dāng)加入氯化鈉的量大于3 μL時(shí)，溶液就會(huì)很快變成藍(lán)紫色。因此，氯化鈉溶液的體積選擇為3 μL。

圖3 氯化鈉體積對(duì)吸光度差值的影響

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間不同(10、20、30、40和50 min)，則吸光度差值不同(見圖4)。整個(gè)體系在酶標(biāo)板恒溫振蕩器中(37℃)發(fā)生反應(yīng)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光度差值呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過10 min時(shí)，96孔板中會(huì)產(chǎn)生少量氣泡，導(dǎo)致測量不準(zhǔn)確，故本試驗(yàn)選擇10 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度差值的影響

2.4 可視化的性能研究

2.4.1 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度孔雀石綠進(jìn)行測試。隨著孔雀石綠濃度的不斷增高，溶液吸光度的差值不斷增加，溶液顏色依次變淺。以A650 nm和A520 nm處的差值為縱坐標(biāo)(△A650/A520)，以孔雀石綠的濃度為橫坐標(biāo)，平行測定3次，繪制相關(guān)性曲線，如圖5所示，線性方程為y=0.09936x+0.01098，R2=0.95098，檢出限(LOD)為0.09082 nmol/L。

a-g表示加入的孔雀石的濃度依次為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L

2.4.2 特異性試驗(yàn)

選擇鹽酸四環(huán)素、土霉素、鹽酸金霉素、多四環(huán)素和磺胺二甲嘧啶對(duì)所建方法的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。四環(huán)素、土霉素、鹽酸金霉素、多四環(huán)素為混標(biāo)，記作獸藥。如圖6所示，當(dāng)孔雀石綠存在時(shí)，適配體會(huì)與其特異性結(jié)合，使得納米金失去適配體保護(hù)而與鹽發(fā)生反應(yīng)，此時(shí)的溶液顏色為淺藍(lán)色，吸光度差值變化較大，而其他干擾物質(zhì)存在時(shí)，則變化較小，說明方法的特異性較好，同時(shí)也說明適配體對(duì)孔雀石綠具有高特異性。

圖6 可視化檢測孔雀石綠方法特異性

2.4.3 試驗(yàn)樣品測定結(jié)果

本試驗(yàn)在實(shí)際樣品中應(yīng)用的準(zhǔn)確性和可行性如表1所示，孔雀石綠的回收率為93.3%～116.0%，表明所建方法準(zhǔn)確。

表1 養(yǎng)殖水樣品中孔雀石綠的檢測

3 結(jié)論

檢測的最佳條件為納米金溶液50 μL、納米金顆粒聚集的誘導(dǎo)物氯化鈉(1 mol/L)溶液3 μL、核酸適配體1 mol/L。在最佳試驗(yàn)條件下，孔雀石綠快速定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.09936x+0.01098，R2=0.95098，檢出限為0.09082 nmol/L。加標(biāo)回收率是93.3%～116.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。