TNF-α、IL-10與反復胚胎種植失敗的相關性研究

呂 婧，王玉玲，劉恩鵬，薛德娜，姜愛芳*

1.濰坊市中醫(yī)院(山東 濰坊 261000) 2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心(山東 濰坊 261042)

在過去的幾十年中，人類輔助生殖技術(Assisted Reproductive Technology,ART)得到了飛速發(fā)展，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)也得到了快速發(fā)展和廣泛臨床應用[1]，但胚胎移植后的臨床妊娠率只有40%～50%[2]。相比之下，反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)成為了人類生殖領域的主要挑戰(zhàn)，在IVF-ET中的發(fā)生率達10%[3]。RIF的根本原因是復雜的，無法與機體特定的異常相關聯(lián)，主要影響因素包括以下幾個方面：子宮結(jié)構異常、激素紊亂、免疫學因素、血栓形成和感染等，最終導致RIF的機制可能是多個因素、多種細胞因子共同作用的結(jié)果。然而能被現(xiàn)有機制解釋的RIF約占50%，仍有近一半的RIF患者沒有確切病因。植入的成功主要取決于母體與半同種異體胚胎局部免疫耐受機制的形成，該機制需要一系列細胞因子的相互作用來完成。細胞因子在妊娠的各個階段中都起著重要的作用，尤其是胚胎著床和胚胎發(fā)育的早期[4]。相關研究表明[5]自然殺傷(natural killer,NK)細胞誘導的免疫逃逸機制在胚胎種植中具有重要影響，但淋巴細胞參與的母體妊娠免疫耐受形成是胚胎植入是否成功的關鍵。其中尤以輔助性T細胞(Th)為代表的T淋巴細胞的募集在胚胎植入過程中起著關鍵的作用。本實驗采用免疫組化的方法，主要探究TNF-α、IL-10在子宮內(nèi)膜組織中的表達以及TNF-α、IL-10比例是否存在失衡現(xiàn)象，進一步探究以TNF-α/IL-10為代表的Th1/Th2失衡與不明原因RIF的關系。為不明原因RIF的發(fā)生機制、診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2019年3月-2019年9月于濰坊醫(yī)學院生殖醫(yī)院就診的患者63例，其中因不明原因反復胚胎種植失敗者33例作為實驗組，于月經(jīng)期1～2 d行子宮內(nèi)膜活檢；既往曾于月經(jīng)期1～2 d行子宮內(nèi)膜活檢且病理無異常患者30例作為對照組。實驗組共納入33例，納入標準：①年齡≤35歲；②月經(jīng)規(guī)律、卵巢功能正常；③符合2005年歐洲人類生殖醫(yī)學與胚胎學會(ESHRE)提出的定義：經(jīng)歷3次以上優(yōu)質(zhì)胚胎或多次移植胚胎數(shù)量共計≥10枚依然未能妊娠；④雙方染色體正常；⑤子宮內(nèi)膜活檢前均取得患者知情同意。排除標準：①感染、生殖系統(tǒng)畸形、內(nèi)分泌紊亂、輸卵管積水、卵巢反應不良等因素導致的RIF；②優(yōu)生全項IgM陽性；③自身抗體陽性；④凝血、血常規(guī)異常；⑤女方全身或者局部嚴重的免疫系統(tǒng)疾病。對照組共納入30例，納入標準：①年齡≤35歲；②月經(jīng)規(guī)律、卵巢功能正常；③雙方染色體正常。兩組患者均于月經(jīng)期1～2 d行子宮內(nèi)膜活檢，且活檢當天收集兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、月經(jīng)周期、基礎竇卵泡數(shù)目(AFC)、基礎抗繆勒管激素(AMH)、基礎卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)等一般資料。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1 主要試劑 TNF-α、IL-10一抗，二抗，免疫組化試劑盒均購于武漢博士德公司；DAB顯色試劑盒購于北京中山金橋公司；抗原修復液(EGTA)購于福建邁新公司。

1.2.2 檢測步驟 采用免疫組織化學染色方法檢測兩組子宮內(nèi)膜組織中TNF-α、IL-10的表達。子宮內(nèi)膜活檢后病理標本常規(guī)脫水、包埋，切片，①二甲苯脫蠟、水化；②EGTA微波爐抗原修復；③滴加一抗，4℃過夜；④滴加二抗；⑤DAB顯色；⑥蘇木素復染，返藍，脫水，二甲苯透明；⑦中性樹膠封片。

1.3評價標準根據(jù)鏡檢組織切片染色結(jié)果進行判定。顯微鏡下TNF-α、IL-10主要定位于子宮內(nèi)膜腺體細胞和間質(zhì)細胞的胞質(zhì)及胞膜，以免疫染色出現(xiàn)黃色或至棕褐色顆粒為陽性。陽性信號為黃色、棕黃色、棕褐色，根據(jù)陽性信號的強弱分為弱、中、強三級，并分別計分：陰性為0分，弱為1分，中為2分，強為3分。根據(jù)染色陽性細胞所占比例劃分，陰性為0分，陽性范圍<25%為1分，陽性范圍25%～50%為2分，陽性范圍50%～75%為3分，陽性范圍：75%～100%為4分，上述評分相乘作為每例的總分。

2 結(jié)果

2.1兩組TNF-α、IL-10在子宮內(nèi)膜組織中的表達TNF-α、IL-10在兩組子宮內(nèi)膜組織中均有表達，主要表達于EGC與ESC的胞質(zhì)與胞膜中，染色陽性表達呈黃色至棕褐色(見圖1)；實驗組TNF-α表達高于對照組(P<0.05)；IL-10表達低于對照組；實驗組TNF-α/IL-10比值顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

注：a：TNF-α在實驗組表達；b：TNF-α在對照組表達；c：IL-10在實驗組表達；d：IL-10在對照組表達。

表2 TNF-α、IL-10在子宮內(nèi)膜組織中的表達

2.2 TNF-α、IL-10相關性分析經(jīng)Pearson相關性分析：實驗組子宮內(nèi)膜組織TNF-α、IL-10呈負相關(r=-0.443，P<0.05)；對照組TNF-α、IL-10無相關性(r=0.163，P>0.05)，見表3。

表3 TNF-α、IL-10相關性分析

3 討論

TNF-α是炎癥的中樞調(diào)節(jié)因子，與胚胎植入，胎盤生長以及妊娠結(jié)局都有一定的關系。TNF-α作為Th1型細胞因子的一種，在整個孕妊期間呈增加的趨勢，并且與復發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent Spontaneous Abortion,RSA)、早期流產(chǎn)、先兆子癇和早產(chǎn)以及IL-10減少有關[6]。據(jù)報道[7]與正常妊娠婦女相比，RSA患者血清中TNF-α、INF-γ、IL-6和整體白細胞水平升高。研究表明[8]TNF-α低水平可以認為是試管嬰兒成功的可靠預測。TNF-α在胚胎植入初始階段起著非常重要的作用，能夠誘導蛻膜化過程中T淋巴細胞的聚集，為母胎免疫界面的建立提供初始動力。當TNF-α表達過高時，通過負反饋機制抑制子宮內(nèi)膜蛻膜化，并且能夠產(chǎn)生放大作用引起相關Th1型細胞因子分泌的增加，產(chǎn)生細胞毒性作用；TNF-α表達過高還可以改變體內(nèi)甾體激素與受體的結(jié)合并誘導細胞凋亡機制的產(chǎn)生，導致腎上腺皮質(zhì)分泌增加活化基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，進一步損傷胚胎滋養(yǎng)細胞的外基質(zhì)，使得相關蛋白質(zhì)發(fā)生功能的改變，進一步協(xié)同作用引發(fā)早期妊娠丟失。本實驗中，實驗組TNF-α高表達，表明TNF-α與不明原因RIF之間具有一定的關系，進而推測出TNF-α所代表的Th1型細胞因子與不明原因RIF有一定的關系，其結(jié)果表明Th1型細胞因子在不明原因RIF患者子宮內(nèi)膜組中整體水平可能是增加的。

IL-10作為一種廣泛的免疫抑制細胞因子在妊娠期間存在于各種組織和體液中，包括胚胎干細胞和合體滋養(yǎng)層細胞以及蛻膜組織中所分泌的單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和NK細胞，均能在胚胎發(fā)育早期、妊娠早期自發(fā)分泌IL-4和IL-10[9]，IL-10由Th2細胞分泌，并認為Th2細胞的存在是成功妊娠的必要條件[10]。正常婦女的羊水和母體血清中也發(fā)現(xiàn)了高水平的IL-10[11]。Ahmadi M等[8]研究表明，IL-10是誘導母體界面免疫耐受的重要細胞因子，可以誘導胚胎滋養(yǎng)細胞表達人類白細胞抗原-G(HLA-G)分子，HLA-G分子表達的增加能夠降低細胞毒性T細胞的分泌，在胚胎種植和維持妊娠中發(fā)揮重要作用。Koushaeian L等[12]研究發(fā)現(xiàn)IL-10具有預防多種免疫細胞產(chǎn)生炎癥反應的能力，產(chǎn)生IL-10的淋巴細胞群可以通過其配體機制調(diào)節(jié)植入過程中的免疫反應，并控制漿細胞中自身抗體的產(chǎn)生從而使胚胎成功植入，但是IL-10下調(diào)可影響胚胎種植，進一步導致RIF。本實驗中，實驗組IL-10低表達，表明IL-10與不明原因RIF具有一定的關系，進而推測出IL-10所代表的Th2細胞與不明原因RIF有一定的關系，在RIF中整體可能是減少的。

研究表明TNF-α或IL-10的變化與RIF存在關聯(lián)[13]，并認為在IVF-ET中出現(xiàn)的RIF患者中，植入失敗是由于Th1型細胞因子相對于Th2、Th3型細胞因子的分泌過盛，進一步推測認為在胚胎種植和妊娠期間TNF-α和IL-10的作用似乎是拮抗性，其性質(zhì)可能取決于它們之間的平衡。母體子宮內(nèi)膜及胚胎滋養(yǎng)層都能產(chǎn)生這兩種細胞因子，母胎免疫平衡在植入中和胎盤中起主要作用。TNF-α/IL-10失衡是導致妊娠早期和晚期并發(fā)癥的重要影響因素，特別是在胚胎植入失敗、早期流產(chǎn)、反復早期自然流產(chǎn)、妊高征、先兆子癇、早產(chǎn)和妊娠期糖尿病等[14]都具有一定的影響。而將這兩種細胞因子一起用來研究不明原因RIF的相關文獻極少。本實驗中，實驗組TNF-α高表達、IL-10低表達，實驗組中TNF-α/IL-10比值顯著高于對照組(P<0.05)，均表明TNF-α/IL-10失衡與不明原因RIF之間具有一定的關系，且TNF-α與IL-10之間也具有相關性，進一步說明其對不明原因RIF的影響。從而也推測出TNF-α代表的Th1型細胞因子與IL-10細胞代表的Th2型細胞因子均與不明原因RIF具有一定的關系，Th1/Th2細胞比例失衡可能與不明原因RIF之間也具有一定的關系。

綜上所述，子宮內(nèi)膜組織中TNF-α高表達、IL-10低表達導致TNF-α/IL-10比例失衡從而引起胚胎種植障礙，是不明原因RIF的重要因素之一，但其具體的作用機制仍需進一步研究證實。