過(guò)表達(dá)OsOMTL1（O-Methyltransferase like 1）增強(qiáng)水稻苗期耐冷性

熊文濤，羅世友，沈雨民，熊煥金，吳小燕，肖葉青，陳明亮*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，江西 南昌 330200；2.水稻國(guó)家工程研究中心(南昌)/國(guó)家水稻改良中心 南昌分中心，江西 南昌330200）

【研究意義】水稻是世界主要的糧食作物之一，是半數(shù)人口的主糧。低溫冷害是水稻常見(jiàn)的氣象災(zāi)害。在我國(guó)高緯度高海拔地區(qū)，在雙季稻區(qū)早稻的倒春寒和晚稻的寒露風(fēng)，均有不同程度的低溫冷害，嚴(yán)重影響了水稻的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。在低溫脅迫下，水稻會(huì)產(chǎn)生一系列的生理代謝變化的應(yīng)激反應(yīng)，包括葉綠素含量的改變，植物內(nèi)源激素ABA 和GA 的改變，丙二醛、蔗糖、脯氨酸等代謝的積累等[2-3]。【前人研究進(jìn)展】水稻耐冷性也是由多種不同分子機(jī)制協(xié)調(diào)產(chǎn)生，是復(fù)雜的數(shù)量性狀（QTLs）。對(duì)水稻低溫脅迫分子生物學(xué)研究的逐步深入，定位及克隆的水稻耐冷相關(guān)遺傳位點(diǎn)和基因越來(lái)越多見(jiàn)報(bào)道[4-6]。GSZ2，編碼馬來(lái)酰乙酰乙酸異構(gòu)酶，第99位的苯丙氨酸的變異會(huì)導(dǎo)致酶活的下降，降低水稻耐冷性[7]。COLD1，編碼一個(gè)G 蛋白調(diào)節(jié)因子，在低溫響應(yīng)時(shí)與G 蛋白α 亞基RGA1 互作激活鈣通路，提高水稻耐冷性[8]。bZIP73，編碼一個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與bZIP71 互作調(diào)節(jié)脫落酸水平和活性氧平衡，提高水稻耐冷性[9]。Os-CNGC9，編碼環(huán)核苷酸離子通道蛋白，低溫下誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流，提高胞質(zhì)鈣含量，增強(qiáng)水稻的耐冷性[10]。HAN1，編碼細(xì)胞色素P450 家族的單加氧化酶，在MYB 轉(zhuǎn)錄因子的影響下調(diào)控茉莉酸介導(dǎo)的低溫響應(yīng)，是耐寒性的負(fù)調(diào)控因子[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】東鄉(xiāng)野生稻（簡(jiǎn)稱(chēng)東野）被證明是具有較強(qiáng)耐冷性的水稻資源，目前已經(jīng)從中定位克隆了一些耐冷遺傳位點(diǎn)，但水稻耐冷性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜，還有大量相關(guān)研究需要進(jìn)一步開(kāi)展?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】前期研究從以東野為供體、贛香B 為受體的片段代換系中篩選獲得強(qiáng)耐冷株系IL732。通過(guò)對(duì)贛香B 和強(qiáng)耐冷株系IL732 冷脅迫處理前后進(jìn)行表達(dá)譜重測(cè)序，分析冷脅迫處理前后基因表達(dá)譜差異，通過(guò)生物信息學(xué)手段從中獲得多個(gè)耐冷相關(guān)候選基因[12]。其中LOC_Os11g19840，編碼一個(gè)類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)似蛋白，命名為OsOMTL1（O-Methyltransferase like 1），進(jìn)行功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

贛香B 和以贛香B 為輪回親本，東野為供體親本的耐冷片段代換系IL732 為本研究室所有；OsOMTL1序列克隆自耐冷株系IL732，OsOMTL1的過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建、贛香B的轉(zhuǎn)化再生和陽(yáng)性篩選方法同熊文濤等P[13]轉(zhuǎn)化OsHI-XI。贛香B過(guò)表達(dá)OsOMTL1基因T1代陽(yáng)性植株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 耐冷篩選

各水稻株系苗置于三洋MGC-450BP光照培養(yǎng)箱28 ℃恒溫培養(yǎng)至近3葉1心期時(shí)，放在常溫下3 d進(jìn)行煉苗，在澳柯瑪YC-370 醫(yī)用冷藏箱（8±1）℃低溫下處理3 d，隨后將試驗(yàn)材料置于常溫條件下使其恢復(fù)生長(zhǎng)。7 d后統(tǒng)計(jì)各株系的存活苗數(shù)。以幼苗存活率=存活苗數(shù)/處理前秧苗數(shù)×100%作為苗期耐冷性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選耐冷株系。

1.3 基因表達(dá)分析

贛香B和耐冷株系IL732培養(yǎng)至近3葉1心期時(shí)，放在常溫下3 d進(jìn)行煉苗，（8±1）℃低溫下處理3 d，取處理前和處理后的葉片進(jìn)行定量PCR 分析，以贛香B 常溫表達(dá)量為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；取IL732 常溫下3 葉1 心期不同部位根、莖、葉，以根部表達(dá)量為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；取贛香B 和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)株系常溫下3 葉1 心期葉片，以贛香B 常溫為參照計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。定量PCR 引物為OsActin-F：5'-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3'；OsActin-R：5'-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3'；OsOMTL1-F：5'-CGCAAAGATGGAGGGAAGGT-3'，OsOMTL1-R：5'-GCCAGTCATTTTCGTCTCGC-3'；每個(gè)樣品檢測(cè)3次重復(fù)，每次隨機(jī)取5棵苗進(jìn)行混樣。

1.4 亞細(xì)胞定位

以耐冷株系IL732 cDNA 為模板擴(kuò)增OsOMTL1，前引物：5'-CTAGTCTTAAGTCCGGAGCTAGCTC TAGAATGGCAGGTCAGGCTCCCAA-3'；后引物：5'-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGATCCCGGATAGA CCTCAAAGACAGCT-3'，獲得目的片段用XbaI 與BamHI 雙酶切與瞬時(shí)表達(dá)載體PAN580-GFP 進(jìn)行重組，PCR測(cè)序驗(yàn)證后挑選陽(yáng)性克隆，與核標(biāo)記質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，弱光下培養(yǎng)8～10 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位。

1.5 基因分型作圖

登錄RiceVarmap 網(wǎng)站（http://ricevarmap2.ncpgr.cn），對(duì)OsOMTL1（LOC_Os11g19840）進(jìn)行SNP 分析，挑選其中具有非同義變異SNP對(duì)RiceVarmap網(wǎng)站中總計(jì)4 692份水稻種質(zhì)材料進(jìn)行單倍體分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因耐冷性驗(yàn)證

贛香B 和轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)OsOMTL1贛香的T1種子均發(fā)芽正常，但從葉片伸出開(kāi)始，過(guò)表達(dá)OsOMTL1株系生物量顯著低于贛香B，生長(zhǎng)受到抑制（圖1A）；表達(dá)量分析表明過(guò)表達(dá)株系中OsOMTL1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于贛香B（圖1B）；苗期冷脅迫處理后，贛香B存活率為0%，而過(guò)表達(dá)OsOMTL1贛香株系存活率為26.3%，過(guò)表達(dá)株系耐冷性顯著強(qiáng)于贛香B（圖1C）。

圖1 過(guò)表達(dá)OsOMTL1植株耐冷鑒定Fig.1 Identification of cold tolerance of rice lines with overexpressing OsOMTL1

2.2 基因表達(dá)分析

對(duì)OsOMTL1進(jìn)行表達(dá)分析研究，該基因在3 d 低溫處理后表達(dá)量顯著上升，在耐冷株系IL732 中表達(dá)量常溫和低溫均顯著高于贛香B（圖2A）；該基因主要在葉片中表達(dá)，根部和莖里表達(dá)較低（圖2B）。原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位表明該基因編碼蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中（圖2C）。

圖2 OsOMTL1表達(dá)模式研究Fig.2 Expression pattern of OsOMTL1

2.3 基因單倍型分析

通過(guò)OsOMTL1基因編碼區(qū)7 個(gè)非同義變異SNP 對(duì)RiceVarmap 網(wǎng)站中4 692 份水稻種質(zhì)材料進(jìn)行分析，OsOMTL1可以分為5 個(gè)基因單倍型，其中以I 型和II 型為主，存在明顯的秈粳分化（表1）。水稻亞種的分型分布表明粳稻主要在I 類(lèi)單倍型中，而秈稻和Aus稻主要在II 和III 類(lèi)單倍型中，IV 和V 類(lèi)單倍型是稀有的類(lèi)型（圖3）。序列檢測(cè)結(jié)果表明耐冷株系IL732 中OsOMTL1為I 類(lèi)單倍型，與日本晴中該基因序列相同，而對(duì)照材料贛香B為II類(lèi)單倍型。

圖3 不用水稻亞種OsOMTL1分型分布Fig.3 Genotyping distribution of OsOMTL1 with rice subspecies

表1 OsOMTL1基因單倍型分析Tab.1 Haplotype analysis of OsOMTL1

3 結(jié)論與討論

水稻耐冷性是受多種分子機(jī)制共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜性狀。保持葉綠體活力、維持電解質(zhì)平衡、提高抗氧化能力、積累可溶性小分子物質(zhì)、調(diào)節(jié)植物激素脫落酸和赤霉素含量等，都有助于提高水稻的耐冷性。其中，提高抗氧化能力是水稻對(duì)于低溫脅迫的重要防御機(jī)制。水稻在遭遇低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧代謝平衡失調(diào)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，造成細(xì)胞傷害。水稻通過(guò)產(chǎn)生各種抗氧化酶（超氧歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT 等）和抗氧化劑（谷胱甘肽GSH、抗壞血酸AsA 等），清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和組織[2,4]。類(lèi)黃酮物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以提高植物對(duì)于多種逆境脅迫的抗性，包括紫外線輻射、干旱脅迫、土壤鋁毒、生物病害等[14-16]。在低溫脅迫下，多種植物會(huì)積累類(lèi)黃酮物質(zhì)，提高耐冷性[17-18]。擬南芥中過(guò)表達(dá)類(lèi)黃酮代謝途徑中的黃酮醇合成酶FLS會(huì)促進(jìn)植株內(nèi)類(lèi)黃酮物質(zhì)的積累，增強(qiáng)對(duì)于多種逆境脅迫的抗性[19]。本研究中通過(guò)低溫脅迫基因表達(dá)譜差異篩選克隆了來(lái)自東稻的冷誘導(dǎo)表達(dá)基因OsOMTL1，編碼一個(gè)類(lèi)黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)似蛋白，可能參與了類(lèi)黃酮物質(zhì)的合成。該基因在水稻耐冷株系IL732中表達(dá)量顯著高于冷敏感材料贛香B，且受到低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。該基因過(guò)表達(dá)水稻植株的苗期耐冷性顯著提高。有研究表明包括OsOMTL1在內(nèi)一些類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)相關(guān)代謝基因參與了水稻對(duì)于紫外輔射的響應(yīng)，表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)了類(lèi)黃酮物質(zhì)的積累[20]。OsOMTL1可能通過(guò)參與水稻體內(nèi)類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)的代謝，增強(qiáng)了水稻植株的耐冷性。

植物生長(zhǎng)和抗逆反應(yīng)中存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理，有研究表明植物逆境脅迫響應(yīng)反應(yīng)中類(lèi)黃酮物質(zhì)的合成對(duì)于植物生長(zhǎng)具有抑制作用。BES1是擬南芥中油菜素甾體（BR）信號(hào)途徑上的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常環(huán)境下BR激活BES1，與多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子結(jié)合抑制它們的表達(dá)量，降低類(lèi)黃酮物質(zhì)的生物合成，促進(jìn)植株生長(zhǎng)；當(dāng)逆境脅迫出現(xiàn)時(shí)，BES1的表達(dá)受到抑制，MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量上升，促進(jìn)類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)積累，抗逆性增強(qiáng)，但植株生長(zhǎng)受到顯著抑制[21]。當(dāng)木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶HCT基因被沉默后，在嚴(yán)重抑制植物生長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)大量積累類(lèi)黃酮物質(zhì)[22]。本研究表明，超表達(dá)OsOMTL1植株苗期雖然顯著提高了耐冷性，但生長(zhǎng)勢(shì)在正常條件下明顯弱于對(duì)照，可能與類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)合成和植物生長(zhǎng)之間的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

在長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境篩選中，粳稻的耐冷性顯著強(qiáng)于秈稻。雖然目前已克隆水稻耐冷基因的分子機(jī)理有很大不同，但大多數(shù)基因核酸序列均存在典型的秈粳分型，且來(lái)自粳稻的基因型可以顯著提高耐冷性，如COLD1、HAN1、CTB4a等[8,11,23-24]。本研究中也存在類(lèi)似的結(jié)果，OsOMTL1存在顯著的秈粳分型，克隆自耐冷株系IL732（來(lái)自東稻）的OsOMTL1屬于粳稻基因型，而對(duì)照冷敏感材料贛香B 屬于秈稻基因型。未來(lái)通過(guò)秈粳稻雜交、復(fù)交，人工低溫高壓篩選將粳稻中的耐冷種質(zhì)導(dǎo)入秈稻，是培育長(zhǎng)江中下游稻作區(qū)耐冷水稻的有效途徑。

致謝：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目（20181CBS004）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！