黑水虻抗菌肽研究進展

章啟慧，李昆太，王 會，王 飛*，王雷雨，陳玉梁，楊鈺妮

（1.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌 330045；2.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001；4.百色學院 農(nóng)業(yè)與食品工程學院，廣西 百色 533000）

濫用抗生素導致病原菌抗藥性增強，甚至催生“超級致病菌”，從而減弱抗生素使用效果。目前，抗生素耐藥性與安全性已被世界衛(wèi)生組織列為全球公共衛(wèi)生的威脅之一。尤其是在抗生素越來越被嚴格限制使用的背景下，尋找綠色安全高效的抗生素替代品成為行業(yè)迫切所需。

昆蟲源抗菌肽因具有良好的抑菌活性、穩(wěn)定性及安全性，被認為是潛在的抗生素替代品之一。作為昆蟲宿主防御機制的代表，抗菌肽廣泛存在于許多昆蟲體內(nèi)，是昆蟲宿主天然免疫系統(tǒng)的主要構成成分。昆蟲抗菌肽主要是由小分子次級代謝物，以及小蛋白和肽組成，對細菌、真菌及病毒等病原體都有著防御機制[1]，具有較大的“替抗”潛力。本文綜述了近年來昆蟲抗菌肽的研究進展，其中就黑水虻抗菌肽的產(chǎn)生機制、評價標準及其應用進行重點闡述，以期為黑水虻抗菌肽的研究與應用提供一定參考。

1 黑水虻抗菌肽的制備與純化方法

在實驗室研究水平，主要是根據(jù)已知的黑水虻抗菌肽基因，通過軟件預測抗菌肽并通過分子生物學技術進行表達抗菌肽是常用方法，也是近年來發(fā)現(xiàn)黑水虻新型抗菌肽的主要方式，但是在實際產(chǎn)業(yè)中，直接從黑水虻幼蟲體內(nèi)提取天然抗菌肽是較為經(jīng)濟實用的方法，也是挖掘黑水虻天然抗菌肽的重要手段。

1.1 黑水虻抗菌肽制備方法

1.1.1 分子技術法 通過分子生物學技術，從黑水虻幼蟲中的cDNA 庫中克隆出抗菌肽編碼基因或是根據(jù)已知的黑水虻抗菌肽編碼序列制備黑水虻抗菌肽。Park 等[2]利用cDNA 末端快速擴增技術克隆得到黑水虻抗菌肽編碼基因DLP1-DLP4及CLP1，Shin 等[3]同樣是利用cDNA 末端快速擴增等技術得到黑水虻抗菌肽rHI-attacin，Elhag 等[4]從黑水虻幼蟲的cDNA 中篩選到7 種抗菌肽基因，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達stomoxynZH1，胡珊珊等[5]通過已知的黑水虻抗菌肽編碼序列設計引物，從黑水虻幼蟲的RNA 中擴增得到DLP-5 抗菌肽序列，Xu 等[6]通過黑水虻轉(zhuǎn)錄組及基因組的交叉驗證，得到在黑水虻幼蟲中表達水平較高的3 個來自于不同家族的抗菌肽基因Hidefensin-1，HiCG13551和Hidiptericin-1，并將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因家蠶系，使得家蠶對昆蟲病原細菌的抗性得到了提高。黑水虻新型抗菌肽的發(fā)現(xiàn)得益于分子生物學技術以及生物信息學的迅速發(fā)展，也是當前獲得黑水虻新型抗菌肽的主要來源。

1.1.2 血淋巴收集法 對個體較大，血淋巴較多的昆蟲一般采用血淋巴收集法。為了防止黑化，在收集昆蟲血淋巴時，收集管內(nèi)一般含有苯基硫脲及相關蛋白酶抑制劑，收集到血淋巴后，需要立即離心，恢復成無細胞的血淋巴，避免凝血，獲得黑水虻抗菌肽粗提物。馮群等[7]使用斷頭取血法收集黑水虻幼蟲免疫后的血淋巴，Alvarez等[8]使用刀剖黑水虻幼蟲腹部，用注射器收集幼蟲血淋巴，獲得抗幽門螺旋桿菌的抗菌肽，周義文等[9]為收集家蠅幼蟲含抗菌肽的血淋巴，使幼蟲表面布滿細菌懸液，用不銹鋼針刺透皮膚，造成損傷感染，24 h 后剪去幼蟲頭部，收集血淋巴。血淋巴收集方法可以得到較純的含有抗菌肽的血淋巴。

1.1.3 研磨提取法 對于個體較小以及血淋巴難以收集的昆蟲，為獲得大量抗菌肽時一般采用研磨或勻漿提取法。Lee等[10]為獲得大量的黑水虻抗菌肽，將感染后的4.5 kg黑水虻進行微波干燥，干燥后研磨成粉末，獲得黑水虻抗菌肽粗制品，Vogel等[11]將黑水虻幼蟲經(jīng)有機試劑粉碎等步驟獲得黑水虻粗制抗菌肽，Kim 等[12]將雙叉犀金龜幼蟲進行干燥研磨，以獲得幼蟲抗菌肽粉末。研磨提取獲得的是昆蟲的粗蛋白制品，由于昆蟲脂肪和其他蛋白較多，存在抗菌肽有效濃度不高的問題。

1.2 黑水虻抗菌肽純化工藝

昆蟲抗菌肽一般為2～7 ku左右大小的小分子肽，在純化過程中，需要考慮昆蟲蛋白種類較多，難以分離出較多種類不同的抗菌肽，純化方式也各有不同。Bhagavathula 等[13]使用配備C18 反相柱HPLC 進行粗抗菌肽提取物的分級。在不同的線性梯度進行洗脫，通過UV-DAD 檢測器監(jiān)測肽峰，根據(jù)保留時間不同收集到4個抗菌肽組分，Ge等[14]通過DEAE-Sepharose 離子色譜分離獲得抗菌肽粗提取物，然后通過Sephacryls-200HR 凝膠過濾層析對粗提物進行分離和純化，減少不可逆結合造成的蛋白質(zhì)損失和失活。Hirsch 等[15]通過固相合成技術在聚合物載體樹脂上制備抗菌肽，經(jīng)反相色譜分析，再通過紫外吸收和電噴霧電離質(zhì)譜檢測抗菌肽的存在并進一步測定抗菌肽含量。上述方法中，Sephacryls-200HR 凝膠過濾層析方法過程簡短，同時也能盡最大可能保持蛋白質(zhì)活性及分子量，但由于抗菌肽特性并不相同，在純化時仍要根據(jù)抗菌肽種類進行純化工藝選擇及優(yōu)化。

2 黑水虻抗菌肽的產(chǎn)生機制及抗菌肽基因

2.1 黑水虻抗菌肽產(chǎn)生機制

昆蟲抗菌肽是在昆蟲進化中獲得的具有抑菌功效的活性物質(zhì)，其中黑水虻是目前被發(fā)現(xiàn)具有較多抗菌肽基因的昆蟲之一。目前普遍認為，昆蟲抗菌肽產(chǎn)生于脂肪體。作為雙翅目模式生物的代表，有關果蠅抗菌肽的產(chǎn)生機制已有大量研究，這也給研究黑水虻抗菌肽產(chǎn)生機制帶來很大啟發(fā)。Tzou 等[16]發(fā)現(xiàn)Toll 和IMD 通路在誘導果蠅產(chǎn)抗菌肽中起作用，Hason 和Lemaitre[17]發(fā)現(xiàn)抗菌肽在塑造腸道生物區(qū)系中的作用沒有得到相同程度的表征，但IMD 缺陷導致果蠅腸道中較高的細菌數(shù)量，進一步支持腸道抗菌肽控制微生物群的觀點，不過IMD 途徑不僅在抗菌免疫反應中起著重要作用，它也參與了許多過程，像細胞競爭、病毒控制、抗脫水等過程，這表明抗菌肽不是一個簡單的免疫效應器。Huang 等[18]通過對黑水虻腸道系統(tǒng)免疫的研究，認為腸道微生物直接或間接影響腸道上皮細胞的免疫功能，進而影響宿主體內(nèi)環(huán)境和發(fā)育，并發(fā)現(xiàn)缺乏抗菌肽表達的Toll 途徑突變體黑水虻幼蟲通常表現(xiàn)為抗藥性降低，遭受由腸道感染導致的致死效應，確定黑水虻幼蟲是利用DUOX-ROS 免疫系統(tǒng)和Toll 信號通路作為腸道免疫防御的手段，BsfDuox 和BsfTLR3 能調(diào)節(jié)腸道關鍵細菌Providencia和Dysgonomonas 的動態(tài)平衡。目前關于黑水虻產(chǎn)生抗菌肽的機制尚不明確，現(xiàn)有研究結果表明，Toll和IMD 通路在產(chǎn)抗菌肽的過程中起關鍵作用，但仍需深入研究產(chǎn)生其作用機制，明確黑水虻抗菌肽分泌的信號轉(zhuǎn)導機制。

2.2 黑水虻抗菌肽基因

因采用的注釋方式及數(shù)據(jù)庫不同，所獲得的黑水虻抗菌肽基因也略有不同。Moretta 等[19]借助生物信息學手段從黑水虻幼蟲及雄雌成蟲的轉(zhuǎn)錄組中推斷出57 種不同的抗菌肽，包括防御素、抗菌肽、附著蛋白和溶菌酶等，Zhan 等[20]從黑水虻幼蟲基因中篩選出能夠編碼50 種抗菌肽的基因，其中包括36 種cecropin 抗菌肽基因。NCBI 上現(xiàn)有黑水虻蛋白質(zhì)組學（BioProject：PRJNA683030）數(shù)據(jù)顯示，被成功注釋的黑水虻抗菌肽共有52 種（表1），其中cecropin 類抗菌肽36 種，attacin 類抗菌肽4 種，防御素類抗菌肽12 種。

表1 黑水虻抗菌肽基因的基本信息Tab.1 Basic information of antimicrobial peptide gene of black soldier fly

3 黑水虻抗菌肽的抑菌機制及評價方法

3.1 黑水虻抗菌肽的抑菌機制

不同抗菌肽的抑菌機制有所不同，目前抗菌肽與細菌相互作用機制，較被認可的兩種觀點分別是抗菌肽對細菌膜作用機理和抗菌肽對細菌細胞內(nèi)殺傷機理[21]。抗菌肽可通過膜溶解機制導致細菌膜上的孔隙形成，或與磷脂相互作用，導致脂膜中的微觀異質(zhì)性，從而致使病原細菌死亡[22]?？咕膶毦毎さ耐高^作用機制分為三類：桶壁模型，抗菌肽滲透通過雙層磷脂；環(huán)孔模型，抗菌肽與脂質(zhì)頭部基團相互作用，誘導雙層彎曲并垂直插入膜雙層；地毯模型，抗菌肽覆蓋整個細胞膜，使得抗菌肽的非極性側鏈與膜疏水核結合，而極性殘基與磷脂結合，與碎片膜形成膠束[23]?？咕膶毦毎麅?nèi)殺傷機理主要是通過與細胞膜內(nèi)的特異性酶結合或作用于細胞內(nèi)DNA、RNA[24]，此類抗菌肽不作用于細菌細胞膜，而是進入細胞膜內(nèi)進行殺菌。

圖1 抗菌肽與細菌膜相互作用模型[23]Fig.1 Interaction model between antimicrobial peptides and bacterial membrane[23]

3.2 黑水虻抗菌肽的抗菌活性和穩(wěn)定性評價方法

3.2.1 評價抗菌活性及抑菌率 對于抗菌活性及抑菌率的評價，盡管目標病原菌不同，但采用的評價方法相對一致。Lee等[10]采用徑向擴散法研究了干酪乳桿菌免疫的黑水虻血淋巴對3種沙門氏菌的抗菌活性，根據(jù)徑向擴散的面積來評價抑菌率。與徑向擴散法較為相似的是抑制區(qū)試驗法。抑制區(qū)試驗法是最簡單也是較為通用的抑菌評價方法，其中又能分為牛津杯法、濾紙片法、打孔法等。Elhag 等[4]采用牛津杯法，將純化的抗菌蛋白加入牛津杯中，培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑。Choi等[25]采用濾紙片法，將濾紙片浸入黑水虻幼蟲不同抗菌肽提取液，培養(yǎng)后以濾紙片周邊透明圈為抑菌圈直徑，Park 等[26]使用打孔法在固體培養(yǎng)基中打直徑為3 mm 的孔洞，每孔加入抗菌肽樣品，培養(yǎng)后測量透明帶直徑，以抑菌圈直徑大小來評價抑菌活性及抑菌率。

液體抑菌法也是評價抗菌肽活性的方法之一，在病原菌培養(yǎng)的過程中，添加抗菌肽稀釋液能一定程度上抑制病原菌的生長，也可以根據(jù)稀釋液濃度測定最小抑菌濃度來評價抑菌活性及抑菌率。李尚偉等[27]在96 孔板中加入100 μL 對數(shù)期細菌，再加入10 μL 抗菌肽樣品，經(jīng)過24 h 培養(yǎng)后，用酶標儀在600 nm 處測定吸光值，以此確定細菌生長的最小抑菌濃度。液體抑菌所用抗菌肽樣品量少，適用于小型試驗。

3.2.2 評價抗菌肽穩(wěn)定性 抗菌肽的穩(wěn)定性多從pH、溫度、紫外照射等方面進行評價研究。趙啟鳳[28]將黑水虻抗菌肽樣品放置溫度為25，37和50 ℃水浴加熱10 min，同時也用鹽酸與氨水配比好的pH 為1、3、5、7、9、11的溶液與黑水虻抗菌肽樣品等體積混合，發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲抗菌肽熱穩(wěn)定性較好，同時也具有一定的抗酸堿能力，在一定的pH 范圍內(nèi)能維持抗菌肽活性。岳陽[29]以100 ℃，20 min 條件處理蠶蛹抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌的抑菌效果基本保持不變，同時也發(fā)現(xiàn)分離得到的蠶蛹抗菌肽是性質(zhì)穩(wěn)定的抗菌肽，在室溫下一定時間內(nèi)能夠保持穩(wěn)定活性。黑水虻抗菌肽與大多數(shù)昆蟲抗菌肽一樣，都有著較強的耐熱性，能夠在一定條件下維持抑菌活性的穩(wěn)定。

4 黑水虻抗菌肽的應用及前景

黑水虻是一種高蛋白昆蟲資源，聯(lián)合國FAO 曾在2013 年推出《可食用昆蟲報告》，其中黑水虻作為替代畜禽蛋白飼料前景最具優(yōu)勢的昆蟲。同時，黑水虻在不同飼養(yǎng)基質(zhì)下可表達不同種類的抗菌肽，這為黑水虻養(yǎng)殖過程高產(chǎn)抗菌肽提供了科學依據(jù)。圖2為黑水虻資源及抗菌肽應用方案，即通過將黑水虻轉(zhuǎn)化不同底物獲得鮮蟲過程作為黑水虻轉(zhuǎn)化處理系統(tǒng)，對鮮蟲中的抗菌肽進行深加工，最終應用到生物醫(yī)學、養(yǎng)殖行業(yè)和食品行業(yè)等領域。

圖2 黑水虻資源及抗菌肽應用方案Fig.2 Black soldier fly resources and application scheme of antimicrobial peptides

4.1 在生物醫(yī)學領域的應用

在中醫(yī)歷史上，昆蟲抗菌肽的藥用價值非常豐富。例如家蠅幼蟲粉與其他中藥混合，是治療傳染病的有效復方藥物?？咕脑趪H上已應用于臨床治療腦膜炎、幽門螺桿菌感染和真菌感染。德國和美國臨床應用抗菌肽治療術后真菌感染和重癥肺炎的報道較多。Hong 等[30]開發(fā)自組裝的納米抗菌肽，可作為傷口愈合的抗感染劑。Kalsy 等[31]發(fā)現(xiàn)來自大蠟蛾的天蠶素A 可以破壞尿病原性大腸桿菌的生物膜，從而解決抗生素無法徹底根除由尿病原性大腸桿菌導致的尿路反復感染的問題。Xu 等[32]發(fā)現(xiàn)家蠶抗菌肽對人食管癌細胞具有抗腫瘤活性。馮群等[7]研究發(fā)現(xiàn)黑水虻抗菌肽粗提物對癌細胞的增殖具有一定抑制作用。黑水虻抗菌肽種類繁多且具有較廣的抑菌譜，是未來生物醫(yī)藥研發(fā)的來源之一，同時也是解決細菌耐藥性的方案之一。

4.2 在養(yǎng)殖業(yè)領域的應用

喂養(yǎng)抗菌肽不僅可以提高生產(chǎn)性能，還能抑制養(yǎng)殖中的病原菌。如免疫柞蠶蛹血淋巴可減輕斷奶仔豬的腹瀉，在飼養(yǎng)奶牛時，在日糧中添加抗菌肽可以顯著提高奶牛乳蛋白率和奶牛產(chǎn)奶量[33]。將抗菌肽添加到肉雞日糧中，顯著提高肉雞的活重、屠體重、全凈膛重、腿肌重和腿肌率等[34]。抗菌肽Surfactin可對吉富羅非魚腸道健康指標產(chǎn)生有益影響[35]，可提高吉富羅非魚腸道皺襞高度，調(diào)節(jié)腸道菌群，提高腸道抗氧化能力，從而改善吉富羅非魚腸道健康狀態(tài)。黑水虻目前可以作為替代蛋白加入到養(yǎng)殖日糧中，同時黑水虻抗菌肽替代養(yǎng)殖抗生素，展現(xiàn)出非?？善诘陌l(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>

4.3 在食品領域的應用

在食品領域中，因化學防腐劑對人體具有一定的危害，使得綠色安全高效的生物防腐劑備受關注。Nisin 是目前使用最廣泛的細菌素，同樣也是抗菌肽的一種，在美國已被授予食品公認安全的地位，并已被用于各種食品中以控制和預防單核細胞增多性李斯特菌。Yaron 等[36]從樹蛙皮膚中分離得到抗菌肽，在蘋果汁有明顯的抑菌活性，表明抗菌肽可以作為潛在的食品防腐劑。黑水虻抗菌肽可以殺滅食品來源性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，為黑水虻抗菌肽在食品領域發(fā)揮抗菌效果提供基礎。

5 結論與展望

昆蟲抗菌肽的作用機制非常保守，并且在數(shù)百年的進化中已經(jīng)形成，這表明其耐藥性的風險較低。黑水虻抗菌肽可以保護生物體免受細菌和真菌的侵襲，最有可能成為替代抗生素的產(chǎn)品之一，要促進黑水虻抗菌肽大規(guī)模的生產(chǎn)與應用，未來研究可側重以下幾方面：

（1）進一步明確黑水虻抗菌肽的產(chǎn)生機制。通過明確黑水虻腸道菌群與抗菌肽之間的關系，闡釋黑水虻抗菌肽的分泌特征和蟲體抗菌肽分泌的信號轉(zhuǎn)導機制，為抗菌肽高產(chǎn)工藝提供理論指導。

（2）建立黑水虻抗菌肽的評價體系。因黑水虻抗菌肽為小分子抑菌蛋白，在評價黑水虻抗菌肽時，可以從抑菌性和蛋白質(zhì)特性進行評價，同時根據(jù)黑水虻抗菌肽在不同領域的應用，一并形成一套較為完整的黑水虻抗菌肽評價體系。

（3）黑水虻抗菌肽的推廣應用。黑水虻對固體廢物的轉(zhuǎn)化，能把廢棄物轉(zhuǎn)化為高蛋白，其被認為是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，并且黑水虻抗菌肽的熱穩(wěn)定性較好，可以忍受飼料生產(chǎn)的溫度。因此，黑水虻抗菌肽用作飼料添加劑極具推廣價值。盡管黑水虻體內(nèi)抗菌肽的產(chǎn)生，能使基質(zhì)的病原菌減少，但不管是黑水虻本身還是黑水虻抗菌肽作為飼料添加劑，其應用的安全性需要充分考慮，這也是促進建立黑水虻抗菌肽評價體系的原因之一。

致謝：廣東海洋大學科研啟動費資助項目（060302042006）同時對本研究給予了資助，謹致謝意！