中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的形成與調(diào)控

歐陽(yáng)慧敏 ， 李錦宏 ， 郭建波 ， 孫 遜 ， 李欣然，2 ， 曹嫦妤，2

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 ， 廣東 佛山 528225 ；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院附屬教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院 ， 廣東 佛山 528225)

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細(xì)胞參與免疫防疫的重要途徑。科學(xué)家最初認(rèn)為NETs作為中性粒細(xì)胞的一種防御手段，有助于宿主的先天免疫，還可以捕殺金黃色葡萄球菌、白色念珠菌酵母相和菌絲相等多種病原體，起到免疫抗菌的作用，防御病原體入侵；隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)NETs有“雙刃劍”的作用：當(dāng)機(jī)體不能保證NETs產(chǎn)生和降解平衡時(shí)，NETs可能反過(guò)來(lái)作為自身抗原，引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，參與自身免疫性疾病[1-2]、腫瘤[3]和炎性疾病[4-5]等的發(fā)生或發(fā)展過(guò)程，導(dǎo)致機(jī)體組織受損。NETs對(duì)馬、奶牛、豬以及伴侶動(dòng)物疾病的預(yù)防和誘發(fā)過(guò)程都有影響。本文從NETs的形成和調(diào)控、疾病的預(yù)防和誘發(fā)進(jìn)程等方面予以綜述，旨在為獸醫(yī)研究NETs的作用機(jī)制和藥物靶向應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 NETs的形成

2004年，Brinkmann等[6]發(fā)現(xiàn)，在白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)、肉豆蔻酸佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)以及脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激后，中性粒細(xì)胞中形成了特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)高分辨率掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其是以DNA為骨架結(jié)構(gòu)，并固定有各種蛋白顆粒的纖維網(wǎng)狀，命名為NETs，這種結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程稱為NETosis。NETosis是一種不同于壞死和凋亡的中性粒細(xì)胞新型死亡方式[7-8]。早期研究發(fā)現(xiàn)，NETs的構(gòu)成包含髓過(guò)氧化酶(Myeloperoxidase，MPO)、組織蛋白酶G(Cathepsin G，CTSG)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)等顆粒蛋白[9]。隨著研究深入，科學(xué)家進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了NETs組成中除顆粒蛋白外的其他蛋白成分。且采用不同的NETs收集程序或蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)檢測(cè)出的蛋白組分略有差異。這些組分與NETs在動(dòng)物疾病中的生理作用密切相關(guān)。

中性粒細(xì)胞是機(jī)體先天免疫的重要參與者，研究發(fā)現(xiàn)NETs的形成(NETosis)是中性粒細(xì)胞清除病原的有效途徑。NETs的形成主要依賴于葡萄糖糖酵解，一定程度上依賴谷氨酰胺、腺膘呤核苷三磷酸(ATP)和酶[10]。當(dāng)中性粒細(xì)胞受微生物、細(xì)菌產(chǎn)物、化學(xué)試劑等刺激活化后，可以通過(guò)2種途徑啟動(dòng)NETosis，一種是經(jīng)典型的NETosis，主要由NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)介導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)，引起氧化應(yīng)激，線粒體能量產(chǎn)生和代謝障礙，細(xì)胞核空泡化，最終細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)解聚，質(zhì)膜解體[11]。另一種類(lèi)型的NETosis是NOX非依賴型，是由電壓依賴性鈣激活的鉀通道3(SK3)的開(kāi)放支持[12]，其發(fā)生與生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和熱休克蛋白等細(xì)胞外刺激關(guān)系密切(封二圖1)[11]。

圖1 NRTSD的形成[11],[13]

2 NETs形成的調(diào)控

NETs的發(fā)生與動(dòng)物疾病病理過(guò)程相關(guān)，而不同誘導(dǎo)方式最終產(chǎn)生的NETs有差異，這可能是由于NETosis涉及多種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制所導(dǎo)致[14]。這些生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能對(duì)NETs的生物學(xué)效應(yīng)有不同影響，是目前研究調(diào)控NETs對(duì)相關(guān)疾病影響和新治療策略的著力點(diǎn)。

組蛋白瓜氨酸化(Citrullinated histone H3，H3Cit)被認(rèn)為是體內(nèi)和體外誘導(dǎo)后NETosis形成的關(guān)鍵早期步驟，評(píng)估早期H3Cit水平可作為預(yù)測(cè)后期NETosis的指標(biāo)，是NETs形成的生物標(biāo)志物之一[15]。Gavillet等[16]通過(guò)對(duì)條件基因敲除小鼠使用離子霉素和PMA誘導(dǎo)后檢測(cè)純化多形核中性粒細(xì)胞NETosis及H3Cit水平變化的研究，發(fā)現(xiàn)Vav/Rac/Pak信號(hào)級(jí)聯(lián)影響NETs的形成；Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)和Ras相關(guān)的C3肉毒素底物2(Rac2)基因缺失后小鼠多形核中性粒細(xì)胞基礎(chǔ)H3Cit水平顯著降低，經(jīng)離子霉素和PMA誘導(dǎo)的NETosis顯著減少；Rac的激活劑Vav1和Vav3的聯(lián)合缺失也可以在一定程度上減少NETosis；Pak是Rac的效應(yīng)器，主要通過(guò)其N(xiāo)端調(diào)節(jié)黏附區(qū)的p21結(jié)合域與上游調(diào)節(jié)器Rac相互作用從而使Rac/Pak信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活；使用Pak抑制劑IPA-3和PF-3758309處理，均可以減少NETosis，并且IPA-3在5 μmmol/L水平抑制Pak時(shí)，可幾乎完全消除離子霉素和PMA誘導(dǎo)的NETosis。表明Rac和Pak信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)節(jié)NETs形成的一個(gè)有效通路。

P-選擇素的信號(hào)也可以介導(dǎo)NETs的形成。用凝血酶激活的血小板與中性粒細(xì)胞也可共同誘導(dǎo)NETosis。而血小板-中性粒細(xì)胞的相互作用主要是由P-選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互影響。P-選擇素是一種糖蛋白，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的棒桿狀Weibel-Palade小體的小體膜及血小板α顆粒膜上。其配體是唾液酸化路易斯，高親和力的配體是P-選擇素糖蛋白配體1，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。Etulain等[17]通過(guò)小鼠體外誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P-選擇素激活中性粒細(xì)胞整合素，活化血小板參與NETosis。P-選擇素相關(guān)的信號(hào)建立對(duì)血小板誘導(dǎo)NETs的形成有調(diào)控作用。

不同誘導(dǎo)因素對(duì)NETosis影響不同，造成NETs生成量不同，NETs形成能力或水平高低與許多生理病理過(guò)程有關(guān)?？衫妹撗鹾颂呛怂崦窱(Deoxyribonuclease I，DNase I)加強(qiáng)NETs的降解，或直接將NETs和疾病相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、介導(dǎo)因子作為靶標(biāo)對(duì)NETs生成進(jìn)行調(diào)控。

3 NETs參與機(jī)體免疫過(guò)程

當(dāng)機(jī)體內(nèi)NETs生成和降解達(dá)到平衡，其對(duì)動(dòng)物疾病起有效的先天性免疫作用。NETs的纖維結(jié)構(gòu)可以向炎癥部位局部輸送高濃度的抗菌因子，進(jìn)而將結(jié)合的微生物隔離，殺滅病原體。NETs也可作為一種物理屏障，預(yù)防病原體進(jìn)一步侵入[6]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可感應(yīng)微生物大小并選擇性釋放NETs以抵抗大型病原體。這種選擇依賴于吞噬和NETosis兩個(gè)過(guò)程對(duì)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)的競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)中性粒細(xì)胞遇到較大且無(wú)法被吞噬的微生物時(shí)，由于沒(méi)有吞噬體，NE可以通過(guò)一種不涉及膜融合的替代途徑緩慢釋放到胞漿中。然后NE自由地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)去致密化。這種簡(jiǎn)單而有效的機(jī)制允許吞噬細(xì)胞區(qū)分小病原體和大病原體[18]。中性粒細(xì)胞具有多樣的抗菌方式，在抵御疾病時(shí)，可以選擇實(shí)施有效的抗菌策略以清除病原體，NETs作為其中的一種途徑，對(duì)維護(hù)機(jī)體健康有積極的影響。

NETs對(duì)真菌感染有抵御作用。研究發(fā)現(xiàn)在白色念珠菌感染后，中性粒細(xì)胞釋放的NETs含有鈣衛(wèi)蛋白。動(dòng)物試驗(yàn)已證明鈣衛(wèi)蛋白對(duì)小鼠局限性膿腫、肺念珠菌病和系統(tǒng)性白色念珠菌病的白色念珠菌生長(zhǎng)都有抑制作用。白色念珠菌定殖的區(qū)域顯示有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)覆蓋真菌表面[19]。當(dāng)白色念珠菌侵入機(jī)體時(shí)，與含鈣衛(wèi)蛋白的NETs相互作用，有助于抑制真菌感染。

NETs可以抵御細(xì)菌感染。Li等[20]研究報(bào)道,肽酰基精氨酸脫亞氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)可以催化組蛋白瓜氨酸化，從而誘導(dǎo)染色質(zhì)去致密化，形成NETs。并通過(guò)菌落形成分析和小鼠試驗(yàn)表明，經(jīng)PAD4介導(dǎo)形成的NETs對(duì)痢疾桿菌和化膿性鏈球菌均有殺菌作用。PMA刺激中性粒細(xì)胞生成NETs，通過(guò)過(guò)氧化物酶活性測(cè)定出形成的NETs中含有MPO，對(duì)感染的金黃色葡萄球菌有殺滅作用[21]。NETs在豬鏈球菌清除和炎癥中也有重要作用，有助于防止豬鏈球菌感染。豬鏈球菌2型被認(rèn)為是主要的豬病原體之一，對(duì)豬或與豬肉產(chǎn)品接觸密切的人群存在健康威脅[22]。中性粒細(xì)胞是防御豬鏈球菌2型感染的第一道免疫防線，NETs可發(fā)揮其介導(dǎo)的殺傷作用抵抗豬鏈球菌2型侵入機(jī)體。Zhao等[23]采用了3種豬鏈球菌2型強(qiáng)菌株感染純化的中性粒細(xì)胞，進(jìn)行胞外核酸染料染色后，通過(guò)激光掃描顯微鏡觀察到所有菌株都可以在早期誘導(dǎo)NETs的生成。

此外，王超群等[7]通過(guò)健康母豬外周血分離的多形核中性粒細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，證明NETs的形成與孕酮誘導(dǎo)劑量以及孵育時(shí)間呈正相關(guān)。也有報(bào)道指出引起犬子宮蓄膿的細(xì)菌可以誘發(fā)NETs，但是NETs在該疾病中的利弊還未確定[24]。不可否認(rèn)，NETs在先天性免疫過(guò)程中對(duì)抵御動(dòng)物疾病有幫助。

4 NETs參與疾病過(guò)程損害機(jī)體

雖然對(duì)NETs參與疾病過(guò)程的細(xì)胞機(jī)制還有待研究，但是越來(lái)越多證據(jù)表明NETs除了捕捉和殺死病原體外，與許多疾病有相關(guān)性。

4.1 NETs誘發(fā)組織和細(xì)胞損傷 C型凝集素受體成員Dectin-1是主要的抗真菌吞噬受體之一，通過(guò)外周血中性粒細(xì)胞體外和體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用Dectin-1的吞噬作用作為微生物體積大小的傳感器，可通過(guò)減少中性粒細(xì)胞蛋白向細(xì)胞核的移動(dòng)來(lái)阻止NETs的釋放。Dectin-1缺陷導(dǎo)致吞噬功能受到干擾后，中性粒細(xì)胞可能不加選擇的釋放NETs，導(dǎo)致組織損傷和宿主死亡[18]。

NETs組成成分具有的細(xì)胞毒分子和蛋白酶可能造成組織損傷。魏正凱[25]研究證實(shí)奶牛乳腺導(dǎo)管中，NETs的組蛋白成分可以通過(guò)激活Caspase-1、NLRP3和Caspase-3途徑，誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞焦亡、凋亡和壞死，損傷乳腺組織(封二圖2)。LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，肺組織和支氣管肺泡灌洗液中都檢測(cè)到NETs存在。在通過(guò)NETs對(duì)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用研究中發(fā)現(xiàn)，NETs可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用。而將內(nèi)皮細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞與未消化或DNA消化的NETs共同孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)，NETs所含的DNA成分不改變NETs介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。Saffarzadeh等對(duì)NETs蛋白成分的研究表明，NETs的細(xì)胞毒性在很大程度上是由組蛋白介導(dǎo)的，MPO也在一定程度上介導(dǎo)NETs的細(xì)胞毒性。NETs介導(dǎo)細(xì)胞毒性這一特點(diǎn)表明其可能參與造成肺損傷[26]。

圖2 NRTs對(duì)牛奶乳腺組織損傷作用[25]

肥胖與代謝綜合征在伴侶動(dòng)物中并不少見(jiàn)，其相關(guān)的血管異常表現(xiàn)之一是內(nèi)皮功能障礙，而NETs積累可以對(duì)內(nèi)皮功能造成影響。Gupta等[27]報(bào)道在體外條件下，毒胡蘿卜內(nèi)酯或腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和活化內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)物中檢測(cè)到NETs形成，長(zhǎng)時(shí)間與NETs接觸的內(nèi)皮細(xì)胞死亡，此過(guò)程可能由內(nèi)皮細(xì)胞激活產(chǎn)生的IL-8介導(dǎo)。這種損傷可以通過(guò)加入二苯碘酸抑制NETosis所需的NAPDHA氧化酶途徑或DNase破壞NETs而消除。Wang等[28]采用喂食小鼠高脂肪食物，建立飲食性肥胖小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，模型小鼠中NETs形成標(biāo)志物Cathelicidin相關(guān)抗菌肽顯著增加；試驗(yàn)還顯示，用DNase降解NETs或氯酰胺預(yù)防NETs形成可以恢復(fù)飲食性肥胖小鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。這些發(fā)現(xiàn)都提示NETs在內(nèi)皮功能障礙中起重要作用，并且這種作用對(duì)機(jī)體是不利的。

4.2 NETs促進(jìn)凝血性疾病發(fā)生發(fā)展 NETs是獲得性凝血病的關(guān)鍵激活因子。NETs的有效誘導(dǎo)因子之一是血小板，已有研究證明血小板-中性粒細(xì)胞促進(jìn)NETosis的潛在機(jī)制[29]。當(dāng)血小板、凝血因子和纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上組蛋白和彈性蛋白酶接觸后，血小板活化、聚集，纖維蛋白沉積引起血栓形成，從而阻塞微血管，導(dǎo)致灌注減少和器官損傷[30]。當(dāng)血小板參與NETosis時(shí)，血小板和NETs之間相互作用對(duì)動(dòng)物的炎癥性疾病和血栓形成有促進(jìn)作用，對(duì)機(jī)體健康造成損傷。

NETs與血栓形成有相關(guān)性。趙晶斌等[31]通過(guò)中外數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了自2004年以來(lái)與NETs和靜脈血栓栓塞癥相關(guān)的研究報(bào)道，通過(guò)篩選和總結(jié)表明NETs參與了血栓形成的起始和生長(zhǎng)階段：內(nèi)皮細(xì)胞的活化和Weibel-Palade小體的釋放對(duì)血栓形成起始階段起重要作用，而NETs誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷，促進(jìn)血栓形成；同時(shí)，NETs可以作為血小板黏附聚集的支架；并且NETs組分中彈性蛋白可以使組織因子途徑抑制劑水解而失活，促進(jìn)外源性凝血過(guò)程。而組成成分中組蛋白、DNA與凝血因子之間的相互作用，使NETs參與內(nèi)源性途徑的凝血過(guò)程[31]。Brill等[32]在狒狒試驗(yàn)性下肢深靜脈血栓中，檢測(cè)到細(xì)胞外DNA在血漿中積累，在靜脈血栓中存在DNA及組蛋白。進(jìn)一步通過(guò)下腔靜脈血流限制建立實(shí)驗(yàn)性深靜脈血栓小鼠模型，通過(guò)免疫組化檢測(cè)到血栓中存在NETs的成分，表明NETs促進(jìn)了深靜脈血栓的形成[32]。

4.3 NETs加重自身免疫性疾病 NETs參與自身免疫疾病過(guò)程。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的主要驅(qū)動(dòng)力是巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1beta，IL-1β)。Warnatsch等[1]應(yīng)用小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型發(fā)現(xiàn)，膽固醇晶體既是IL-1β產(chǎn)生的啟動(dòng)信號(hào)，又是激活炎癥小體加工IL-1β的危險(xiǎn)信號(hào)。膽固醇晶體能觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放NETs，NETs啟動(dòng)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，激活動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中擴(kuò)增免疫細(xì)胞募集的輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)。因此，危險(xiǎn)信號(hào)如膽固醇晶體可通過(guò)與中性粒細(xì)胞的相互作用而產(chǎn)生NETs，驅(qū)動(dòng)無(wú)菌性炎癥。此外，未被降解的NETs激活補(bǔ)體可加重系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清對(duì)NETs的降解能力降低，無(wú)法恢復(fù)NETs降解能力的病患病情相對(duì)更加嚴(yán)重，血液中補(bǔ)體蛋白C4和C3水平也較低。補(bǔ)體部分具有結(jié)合DNA潛力的蛋白與NETs相互作用，其中C1q結(jié)合良好，C3b沉積在NETs上。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，C1q抑制血清和純化C1q與DNase-I組成的系統(tǒng)中NETs的降解，并且C1q在生理濃度下不抑制血清中NETs的降解。研究表明，NETs可以激活補(bǔ)體，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生NETs特異性抗體。NETs降解減少導(dǎo)致補(bǔ)體沉積和自身抗體沉積，招募更多補(bǔ)體，形成NETs降解減少和促炎反應(yīng)的惡性循環(huán)[2]。

5 展望

NETs作為非特異性免疫的組成部分之一，是動(dòng)物機(jī)體中不可或缺的一種抵抗病原入侵的途徑。但是在某些情況下，NETs又參與疾病的發(fā)生發(fā)展，造成可能的組織損傷甚至危及動(dòng)物生命。然而，NETs在動(dòng)物疾病發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制還有很廣闊的研究空間和應(yīng)用前景，NETs的有益作用以及有害作用之間的具體界限有待量化。鑒于NETs獨(dú)特的雙面性，怎樣調(diào)控和量化NETs的形成，發(fā)揮其殺滅病原的積極作用，盡量預(yù)防其抑制機(jī)制失調(diào)或被過(guò)度激活帶來(lái)的負(fù)面作用，對(duì)于疾病的防控具有重要的臨床意義。

綜上所述，通過(guò)調(diào)控NETs的形成和抑制可以為動(dòng)物疾病的治療提供新的靶向，但NETs相關(guān)疾病研究目前仍處于起步階段，如何建立NETs靶向以達(dá)到防治疾病的目標(biāo)還需要深入研究。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，NETs可調(diào)控mTOR通路、PI3K-ERK通路和腸細(xì)胞緊密連接通路等，參與由于硒缺乏、鋁中毒以及鎘暴露引起的組織和細(xì)胞損傷。但是，如何把這些分子機(jī)制應(yīng)用到臨床疾病的預(yù)防和治療，還需要更深入的研究。