藏羚羊糞便中大腸埃希菌和腸球菌的分離鑒定與耐藥表型檢測

高 鐸

(遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心 ， 遼寧 沈陽 110036)

大腸埃希菌和腸球菌是人和動物腸道共生菌，均為條件致病菌，可以作為社區(qū)和農(nóng)場中各種細(xì)菌耐藥性發(fā)生情況的指標(biāo)菌[1]。藏羚羊?qū)儆诩顾鲃游镩T、哺乳綱、偶蹄目、牛科、羚羊亞科、藏羚屬，是我國一級保護(hù)動物[2]。由于許多野生動物是人類重要傳染病的自然宿主，可能攜帶和傳播已知或未知的病原體[3]，藏羚羊糞便標(biāo)本中可能含有一定數(shù)量和種類的細(xì)菌。同時，藏羚羊在藏區(qū)內(nèi)基本難以接觸各類藥物，其攜帶的細(xì)菌不易受藥物影響而產(chǎn)生耐藥。對藏羚羊糞便中大腸埃希菌和腸球菌開展耐藥表型檢測，可以初步了解在基本沒有接觸藥物的情況下，藏羚羊所攜帶細(xì)菌的耐藥情況，為研究和監(jiān)測自然環(huán)境下野生動物細(xì)菌耐藥發(fā)展趨勢以及指導(dǎo)野生動物臨床用藥提供一定參考，在獸醫(yī)領(lǐng)域具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。相關(guān)研究表明，從藏羚羊糞便中分離獲得的優(yōu)勢種為檸檬節(jié)桿菌、木聚糖芽孢桿菌、屎腸球菌，也可分離到糞腸球菌、鶉雞腸球菌、堅忍腸球菌等[4]，但總體文獻(xiàn)較少，尤其少見對藏羚羊糞便中分離細(xì)菌進(jìn)行耐藥表型檢測的相關(guān)文獻(xiàn)。因此，本試驗對從藏羚羊糞便中分離得到的大腸埃希菌和腸球菌進(jìn)行了耐藥表型檢測。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 大腸埃希菌質(zhì)控菌株為ATCC25922，糞腸球菌質(zhì)控菌株為ATCC29212，均購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗分離菌株由采自4個地區(qū)的藏羚羊糞便中分離獲得。

1.2 儀器 生物安全柜CLASS Ⅱ(美國NUAIRE公司)、全自動高壓滅菌器(日本三洋電器集團(tuán))、恒溫培養(yǎng)箱(德國BINDER)、VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(BIOMERIEUX)。

1.3 培養(yǎng)基與材料 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基、膽硫乳瓊脂和營養(yǎng)瓊脂，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；法國科馬嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基，購自上海欣中生物工程有限公司；革蘭陽性菌鑒定卡(GP鑒定卡)和革蘭陰性菌鑒定卡(GN鑒定卡)，均購自BIOMERIEUX公司；腸球菌肉湯、7.5%氯化鈉肉湯和營養(yǎng)肉湯，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；革蘭陽性菌和革蘭陰性菌藥敏試驗檢測試劑盒，均購自上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司。

1.4 方法 參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于印發(fā)《2019年動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計劃》的通知[5]中《動物源細(xì)菌分離和鑒定方法》中的方法對大腸埃希菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等細(xì)菌進(jìn)行分離、純化、鑒定和體外藥物敏感性測定。

1.4.1 采樣采集 于4個地區(qū)采集藏羚羊糞便共計15份，0～4 ℃保存運(yùn)輸至實驗室。

1.4.2 分離純化 將糞便樣品于9 mL 0.85%生理鹽水中混勻，分別接種于營養(yǎng)肉湯、腸球菌肉湯、7.5%氯化鈉肉湯和緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中，按規(guī)定的溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)后分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基和金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基中，按規(guī)定的溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng)。亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)物再接種于沙門菌顯色培養(yǎng)基中，按規(guī)定的溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.3 生化鑒定 將上述不同培養(yǎng)途徑獲得的疑似單菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離，(36±1)℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，懸浮于3 mL 0.45%生理鹽水中，制備0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，放入卡架中，使用GP或GN鑒定卡，按VITEK說明書操作。

1.4.4 藥物敏感性試驗 將無菌棉簽用生理鹽水潤濕后，直接取過夜培養(yǎng)皿上數(shù)個新鮮菌落，與適量無菌生理鹽水混勻。然后，用濁度計校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1×108～2×108CFU/mL)。最后，用試劑盒中的肉湯按照使用說明書要求的倍數(shù)稀釋，混勻備用。使用全自動細(xì)菌加樣器，將菌液分別注入含有系列抗菌藥物溶液的藥敏試驗檢測試劑盒中，(36±1) ℃培養(yǎng)24 h。對革蘭陰性菌進(jìn)行了14種藥物的藥物敏感性試驗；對革蘭陽性菌進(jìn)行了19種藥物的藥物敏感性試驗。使用大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212，對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)結(jié)果參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《2019年動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計劃》規(guī)定的抗微生物抗菌藥物敏感性試驗的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。質(zhì)控菌株的MIC結(jié)果均在規(guī)定范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 經(jīng)分離純化和生化鑒定，從15份樣品中共分離得到革蘭陰性菌10株，均為大腸埃希菌；革蘭陽性菌17株，其中腸球菌15株，其他2株；腸球菌中，糞腸球菌1株、屎腸球菌4株、鶉雞腸球菌5株、海氏腸球菌2株、鉛黃腸球菌2株、堅忍腸球菌1株；其他菌種中，克氏庫克菌1株，嬰兒鏈球菌1株。有3份樣品同時分離出2種革蘭陽性菌，有10份樣品同時分離出革蘭陽性菌和陰性菌，其中1份樣品同時分離出2種革蘭陽性菌和1種革蘭陰性菌。15份樣品中的14份樣品分離得到腸球菌，分離率為93.3%，10份樣品分離得到大腸埃希菌，分離率為66.7%。未分離到沙門菌和金黃色葡萄球菌。

2.2 藥物敏感性試驗 結(jié)果如表1和表2所示。分離的10株大腸埃希菌對慶大霉素、大觀霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氧氟沙星、黏菌素、美羅培南和頭孢他啶敏感；對磺胺異噁唑耐藥率最高，達(dá)80%，其次是氟苯尼考，耐藥率為40%；1株大腸埃希菌對氨芐西林高水平耐藥，1株對頭孢噻呋耐藥，1株對阿莫西林/克拉維酸低水平耐藥；10株大腸埃希菌中，2株對2種抗菌藥物呈現(xiàn)耐藥，多重耐藥菌僅1株，為3重耐藥菌株。總體來看，分離的大腸埃希菌對14種抗菌藥物的敏感性普遍較高，僅少數(shù)菌株表現(xiàn)出一定的多重耐藥性。分離的15株腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、青霉素、復(fù)方新諾明、萬古霉素、四環(huán)素和多西環(huán)素敏感；對苯唑西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素和磺胺異噁唑的耐藥情況比較嚴(yán)重，耐藥率均在90%以上，其中對泰妙菌素、磺胺異噁唑和頭孢西丁3種藥物耐藥率達(dá)到了100%；其次是對替米考星和氧氟沙星耐藥率較高，分別達(dá)73%和60%。腸球菌對19種抗菌藥物的多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重。其中，9重耐藥菌為3株，8重耐藥菌為6株，7重耐藥菌為4株，6重耐藥菌為1株，5重耐藥菌為1株。不同菌種的腸球菌表現(xiàn)的耐藥水平和耐藥率差異不顯著，可能與樣本量有關(guān)。

表1 大腸埃細(xì)菌的體外抗菌藥物敏性試驗結(jié)果Table 1 Results of in vitro antimicrobial susceptility test for Escherichia coli

表2 大腸埃細(xì)菌的體外抗菌藥物敏性試驗結(jié)果Table 1 Results of in vitro antimicrobial susceptility test for Escherichia

3 討論

3.1 分離鑒定情況 對15份樣品進(jìn)行大腸埃希菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌的分離鑒定結(jié)果表明，腸球菌和大腸埃希菌在藏羚羊糞便中的存在比較普遍。李俊琴的研究也證實，腸球菌是藏羚羊糞便中的優(yōu)勢菌種[4]。蒙家嘉等[6]在藏原羚中分離得到過海氏腸球菌，本試驗在藏羚羊糞便中也分離到該菌種。本試驗分離的嬰兒鏈球菌、克氏庫克菌、鉛黃腸球菌未見國內(nèi)外相同報道，但李俊琴[4]和Bai等[7]分別從藏羚羊糞便中分離出了玫瑰考克氏菌和藏羚羊鏈球菌。鶉雞腸球菌、屎腸球菌和堅忍腸球菌對人類為致病菌，但在藏羚羊體內(nèi)卻是正常菌群[4]，隨著野生動物和人類接觸的日漸增多，野生動物攜帶細(xì)菌傳播給人類引發(fā)疾病，或人類活動影響野生動物攜帶細(xì)菌耐藥性的情況也可能會增多，應(yīng)當(dāng)給予關(guān)注。本試驗未見金黃色葡萄球菌和沙門菌，與國內(nèi)外研究結(jié)果也較一致，說明藏羚羊并不常見金黃色葡萄球菌和沙門菌引發(fā)的疾病。

3.2 藥物敏感性試驗情況 本試驗分離的大腸埃希菌對14種抗菌藥物總體上較敏感，僅對磺胺異噁唑耐藥菌株較多，對氟苯尼考中度敏感菌株較多，說明藏羚羊糞便中分離的大腸埃希菌耐藥情況并不嚴(yán)重，可能與野生動物未受藥物環(huán)境影響有關(guān)。羊云飛[8]的研究也顯示，藏區(qū)牦牛源大腸埃希菌對磺胺異噁唑和氟苯尼考耐藥率較高，對其他藥物較敏感；分離的大腸埃希菌均對碳青霉烯類代表藥美羅培南較敏感。但本試驗中1株大腸埃希菌對頭孢噻呋耐藥值得關(guān)注，提示可能為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)表型。本試驗中分離的腸球菌對6種藥物敏感，對2種藥物未出現(xiàn)耐藥，但仍然對苯唑西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異噁唑、替米考星等藥物呈現(xiàn)很高的耐藥率。其中，對苯唑西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、磺胺異噁唑耐藥可能是由于腸球菌對頭孢菌素、青霉素、磺胺類天然耐藥[9]。通過與近年來對其他動物源腸球菌耐藥性監(jiān)測的情況進(jìn)行比較[10-12]，分離的腸球菌對慶大霉素、多西環(huán)素、紅霉素、利奈唑胺均呈現(xiàn)較低水平的耐藥，甚至是未出現(xiàn)耐藥；對氟苯尼考耐藥率低于一般地區(qū)的水平，但高于藏區(qū)豬源腸球菌耐藥率；對克林霉素耐藥率較高，值得關(guān)注。

本試驗在藏羚羊糞便中，腸球菌和大腸埃希菌有較高的分離率，而金黃色葡萄球菌和沙門菌較難分離，提示藏羚羊的健康狀態(tài)較好。與國內(nèi)相關(guān)研究相比，藏羚羊糞便中分離的大腸埃希菌和腸球菌耐藥情況總體處于較低水平，但1株大腸埃希菌對頭孢噻呋耐藥，以及腸球菌對克林霉素、泰妙菌素和替米考星耐藥率較高值得關(guān)注。本試驗說明對藏羚羊等生活在高原無人地區(qū)較難接觸藥物的野生動物進(jìn)行耐藥性監(jiān)測具有重要意義。