檸檬桉樹脂多糖的提取純化及其抗氧化活性的研究

何業(yè)通，馬麗，李文，劉雄民，賴芳，陸順忠

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西民族大學(xué) 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530009)

檸檬桉樹脂(Eucalyptus citriodora Resin)是從檸檬按樹(Eucalyptus citriodora)的樹干受傷后流出的深褐色軟脂，經(jīng)過(guò)風(fēng)化后成為黑色硬脂。檸檬桉樹主要分布于國(guó)內(nèi)氣候高溫濕潤(rùn)、陽(yáng)光充足的廣西、廣東以及福建等地區(qū)[1]，已有研究表明其具有解毒斂創(chuàng)、抗腫瘤及驅(qū)蟲功能等[2-3]。對(duì)檸檬桉樹脂的有效成分的研究主要集中在黃酮、多酚類化合物[4-5]，對(duì)檸檬桉樹脂多糖的研究鮮見報(bào)道。

本文通過(guò)水提醇沉法對(duì)檸檬桉樹脂多糖進(jìn)行提取，采用Sevage法和TCA法對(duì)提取的粗多糖進(jìn)行去除蛋白質(zhì)以及采用聚酰胺法去除色素，對(duì)純化前后的ERP進(jìn)行DPPH·和·OH清除測(cè)定。以期為ERP的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

葡萄糖、考馬斯亮藍(lán)G-250、濃硫酸、無(wú)水乙醇、苯酚、三氯乙酸、氯仿、正丁醇、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、牛血清蛋白、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基、抗壞血酸(Vc)均為分析純；聚酰胺粉末(100～200目)，層析柱用；檸檬桉樹脂，采自廣西民族大學(xué)校園內(nèi)檸檬桉樹。

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；DL-6000B低速冷凍離心機(jī)；FA224分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檸檬桉樹脂的預(yù)處理 新鮮摘取的檸檬桉樹脂去除樹皮等雜質(zhì)，風(fēng)干搗碎后備用。

1.2.2 多糖的提取 取20 g預(yù)處理的檸檬桉樹脂，采用熱水浸提法按照料液比1∶20 (g/mL)于95 ℃油浴浸提3次，提取時(shí)間為4 h，取出水提液進(jìn)行抽濾，3 000 r/min下離心15 min。將3次水提液混合并進(jìn)行旋蒸濃縮，在得到的濃縮多糖水提液中緩慢加入體積分?jǐn)?shù)比為75%的無(wú)水乙醇邊加邊攪拌，置于4 ℃ 冰箱保溫過(guò)夜。將醇沉液進(jìn)行3 000 r/min 離心15 min，用丙酮將沉淀物洗出，烘干后得到檸檬桉樹脂粗多糖1.578 g。

1.2.3 苯酚-硫酸法測(cè)定ERP的含量[6]在490 nm 下測(cè)其吸光度。以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=8.479x-0.021 1，決定系數(shù)R2=0.999 2，說(shuō)明葡萄糖質(zhì)量濃度在0～0.08 mg/mL 內(nèi)在波長(zhǎng)490 nm處的吸光值與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)得的多糖得率為7.79%。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[7]在590 nm 處測(cè)定紫外吸光值，繪制蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y=0.034x+ 0.076 2，決定系數(shù)R2=0.999 2，說(shuō)明牛血清蛋白質(zhì)量濃度在3.333～16.667 μg/mL 內(nèi)的波長(zhǎng)590 nm處的吸光值與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。

1.2.5 脫蛋白

1.2.5.1 Sevage法脫蛋白[8]分別取5份4 mL粗多糖提取液，再各加入1 mL Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4 mL∶1 mL)，搖勻3 min，然后將其于3 000 r/min 離心機(jī)中離心15 min去除沉淀，按照上述操作分別進(jìn)行1，3，5，10,15次。

1.2.5.2 三氯乙酸(TCA)除蛋白 分別取5份4 mL 粗多糖提取液，加入TCA，分別得到1%，3%，6%，9%，12%的TCA溶液，振蕩10 min，在4 ℃冰箱中冷藏過(guò)夜。用考馬斯亮藍(lán)法、苯酚-硫酸法分別測(cè)定蛋白質(zhì)去除率和多糖的保留率[9]。

1.2.5.3 多糖保留率和蛋白的去除率的計(jì)算 兩種方法均采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定590 nm處吸光值，按照如下公式可計(jì)算蛋白質(zhì)去除率(R1，%)：

(1)

式中A1——未除蛋白的吸光度；

A2——除蛋白后吸光值。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定490 nm處吸光值，按照下式計(jì)算多糖保留率(R2，%)：

(2)

式中MP——脫蛋白前多糖含量，g；

M——脫蛋白后多糖含量，g。

1.2.6 聚酰胺(PA)柱層析法脫色 選用3.5 cm×40 cm聚酰胺層析柱，裝柱：采用濕法裝柱，聚酰胺的用量與樣品的比值為50 mL∶1 g。上樣：采用濕法上樣。洗脫：洗脫液為蒸餾水，流速為3 mL/min，用苯酚硫酸法進(jìn)行檢測(cè)，洗脫至流出液中檢測(cè)不出糖。收集干燥濃縮，測(cè)其多糖的保留率[10]。通過(guò)紫外分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)量多糖脫色前后的吸光度，按照如下公式可計(jì)算脫色率(R3，%)：

(3)

式中A1——脫色前的吸光度；

A2——脫色后的吸光度。

1.2.7 抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH·自由基清除測(cè)定[11]分別移取2.0 mL濃度為9，12，15，18，21，24，27 mg/mL的Vc、ERPC、ERP1和ERP2，加入0.05 mg/mL DPPH·溶液，混勻并避光放置30 min，以無(wú)水乙醇做參比，測(cè)519 nm處的吸光值，平均測(cè)定3次，取其平均值。

DPPH·自由基清除率(S1，%):

(4)

式中A0——未加入樣品液的DPPH吸光值；

Ai——不同濃度樣品液與DPPH·反應(yīng)后的吸光值。

1.2.7.2 ·OH自由基的清除測(cè)定 采用水楊酸法[12]測(cè)定Vc、ERPC、ERP1和ERP2對(duì)·OH的清除能力。分別移取各樣液中不同濃度(14.8，18.5，22.2，25.9，29.6，33.3，37 mg/mL)各1 mL，加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L水楊酸溶液和8.8 mmol/L H2O2各1 mL，37 ℃水浴30 min，以蒸餾水為空白，測(cè)510 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

·OH自由基清除率(S2，%):

(5)

式中A0——空白對(duì)照的吸光值；

Ai——加樣品的吸光值；

Aj——未加入H2O2的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種脫蛋白方法效果比較

2.1.1 Sevage法 由表1可知，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)的清除率不斷地升高，處理次數(shù)越高則蛋白的清除率越高。當(dāng)處理次數(shù)達(dá)到10次時(shí)，蛋白質(zhì)清除率達(dá)到79.51%，多糖的保留率在53.45%。處理次數(shù)增加會(huì)導(dǎo)致多糖含量的減少，處理次數(shù)達(dá)到15次時(shí)，蛋白的清除率達(dá)到85.17%，但多糖的保留率只有18.97%，雖然有較好的蛋白去除率，但由于處理次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致多糖的損失明顯增加，且成本較高，操作繁瑣。

表1 Sevage法脫蛋白結(jié)果表Table 1 Deproteinization results of Sevage method

2.1.2 TCA法脫蛋白結(jié)果 由表2可知，隨著TCA的濃度增加，蛋白質(zhì)的清除率不斷地升高，多糖的保留率逐漸減少，當(dāng)TCA濃度在6%時(shí)，蛋白質(zhì)的清除率達(dá)到94.79%，多糖的保留率為82.99%，當(dāng)TCA濃度達(dá)到12%時(shí)，蛋白質(zhì)的清除率達(dá)到98.90%，由于TCA濃度增大使得酸性較強(qiáng)，可能導(dǎo)致部分多糖降解，從而使得多糖出現(xiàn)較大的損失。所以多糖的保留率下降，僅為56.21%。

表2 TCA法脫蛋白結(jié)果Table 2 Deproteinization results by TCA method

對(duì)比Sevage法和TCA法對(duì)ERPC進(jìn)行除蛋白，結(jié)果表明，TCA法較Sevage法對(duì)ERPC的除蛋白質(zhì)效果更好，且操作簡(jiǎn)單，TCA的濃度在6%時(shí)，脫蛋白的效果最好，且多糖的保留率也相對(duì)較高。

2.2 聚酰胺(PA)法對(duì)除蛋白后的多糖進(jìn)行脫色和分離

以收集洗脫液的試管序號(hào)為橫坐標(biāo)，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定的各收集管中洗脫液在490 nm處的吸光值(A)為縱坐標(biāo)，繪制出聚酰胺分離柱的洗脫曲線見圖1。

圖1 聚酰胺洗脫曲線Fig.1 Polyamide elution curve

由圖1可知，在7～15管和31～35管處有波峰，對(duì)兩個(gè)部分分別進(jìn)行收集、濃縮。

對(duì)濃縮后的產(chǎn)物在420 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描。通過(guò)公式(3)得到脫色率為77.95%,多糖的保留率為71.94%，其中ERP1含量為31.43%，ERP2含量為40.51%。

2.3 抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 對(duì)DPPH·自由基清除能力 同質(zhì)量濃度的ERPC、ERP1、ERP2以及Vc清除DPPH·自由基的能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，ERPC、ERP1、ERP2以及Vc均對(duì)DPPH自由基具有一定的清除作用，其清除能力由大到小為：Vc>ERPC>ERP2>ERP1。四者均隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH·自由基的清除作用呈先增加后趨于平衡的趨勢(shì)[13]。在質(zhì)量濃度9～27 mg/L 內(nèi)，以清除率(y)與質(zhì)量濃度(x)的關(guān)系進(jìn)行線性擬合見表3。利用擬合方程計(jì)算得到相應(yīng)的IC50值，說(shuō)明經(jīng)過(guò)純化后對(duì)DPPH·自由基依舊保持相對(duì)較好的清除效果。

圖2 ERPC、ERP1、ERP2、Vc不同濃度試樣對(duì)DPPH·的清除能力Fig.2 DPPH· scavenging capacity of samples with different concentrations of ERPC,ERP1,ERP2 and Vc

表3 試樣質(zhì)量濃度(x)與DPPH·自由基清除率(y)的關(guān)系Table 3 Relationship between sample mass concentration (x) and DPPH · radical scavenging rate (y)

2.3.2 對(duì)·OH的清除測(cè)定 同質(zhì)量濃度的ERPC、ERP1、ERP2以及Vc清除·OH的能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 ERPC、ERP1、ERP2、Vc不同濃度試樣對(duì)·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of polysaccharide crude extract,ERP1,ERP2 and Vc on ·OH

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各樣液對(duì)·OH 清除作用隨著濃度的增加清除率增大。各樣液的清除能力大小為：Vc>ERPC>ERP1>ERP2。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，ERPC的最高清除率為88.54%，ERP1的最高清除率為48.42%，ERP2的最高清除率為35.67%。在質(zhì)量濃度15～37 mg/mL 內(nèi)，以清除率(y)與質(zhì)量濃度(x)的關(guān)系進(jìn)行線性擬合見表4。利用擬合方程計(jì)算得到相應(yīng)的IC50值，說(shuō)明ERP經(jīng)過(guò)純化后對(duì)·OH自由基依舊保持相對(duì)較好的清除效果。

表4 試樣質(zhì)量濃度(x)與·OH自由基清除率(y)的關(guān)系Table 4 Relationship between sample mass concentration (x) and ·OH radical scavenging rate (y)

3 結(jié)論

本文利用水提醇沉法對(duì)ERP進(jìn)行提取，得到的多糖提取率為7.79%。比較了Sevage法和TCA法對(duì)ERPC去除蛋白質(zhì)的應(yīng)用效果，其中TCA法除蛋白質(zhì)的效果較好，同時(shí)多糖的保留率相對(duì)較高，在TCA濃度達(dá)到6%時(shí)，多糖的保留率達(dá)到了82.99%，蛋白去除率為94.79%。通過(guò)聚酰胺柱層析對(duì)脫蛋白后的ERP進(jìn)行除色，除色率達(dá)到77.95%，多糖的保留率為71.94%。并得到ERP1、ERP2兩種多糖純化物組分。

對(duì)ERPC、ERP1和ERP2三者進(jìn)行了DPPH·和·OH自由基清除測(cè)定，實(shí)驗(yàn)表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，ERPC、ERP1和ERP2隨著濃度的增加對(duì)DPPH·和·OH的清除率逐漸增加，其中對(duì)DPPH·均有較好的清除作用，三者對(duì)DPPH·自由基清除的IC50值分別為9.82，13.6，11.3 mg/L，而ERP1和ERP2對(duì)·OH的清除能力較弱，三者對(duì)·OH自由基清除的IC50值分別為23.6，26.9，53.7 mg/mL。綜上所述，ERP經(jīng)過(guò)純化后其多糖仍具有一定的抗氧化活性，為檸檬桉樹脂多糖的開發(fā)利用提供了理論參考。