非小細胞肺癌細胞外泌體源性FZD10促進體外血管生成

肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占所有原發(fā)肺癌的85%。盡管新的NSCLC治療方案（如酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療、免疫療法等）的臨床應(yīng)用已取得了一定的進展，但耐藥等因素使其療效還是沒有重大突破，NSCLC患者的死亡率仍然較高。侵襲、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NSCLC患者死亡的關(guān)鍵因素，而血管生成在NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用，而且近年來發(fā)現(xiàn)外泌體可作為細胞間信息交流的媒介參與NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成，從而調(diào)控NSCLC的發(fā)展。

戰(zhàn)士們護著夏國忠沖到江邊，把石副連長的命令傳達給等候在江邊的劃夫。幾名劃夫聽說城中還有國軍在戰(zhàn)斗，自愿要求留下來等候。戰(zhàn)士們心里清楚，副連長他們幾乎沒有了生還的可能，于是不由分說，把幾名劃夫拉上木排，解開拴在江岸上的麻索，木排在劃夫們的操縱下，順江向下游的煙收壩飛快漂去。

Frizzled-10（FZD10）是G蛋白偶聯(lián)受體中的一種亞型，在包括肺鱗癌等多種腫瘤組織和細胞中高表達。研究發(fā)現(xiàn)FZD10可以通過外泌體為介質(zhì)促進腫瘤細胞增殖，而且FZD10還被證實在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與血管生成有關(guān)。但FZD10在NSCLC血管生成中的作用尚不清楚，外泌體源性FZD10對腫瘤血管生成的影響還未見報道。因此，本文擬探討NSCLC細胞來源外泌體中的FZD10（NSCLC 細胞外泌體源性FZD10）對血管生成的影響，以期為NSCLC的防治提供潛在靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞株及細胞培養(yǎng)

NSCLC細胞株95D（中國科學(xué)院細胞庫），NSCLC細胞株H1299 和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）（ATCC），正常人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）（賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司）。95D、H1299 和BEAS-2B細胞使用RPMI 1640+10%胎牛血清（去外泌體血清）+1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng)，HUVEC 使用DMEM+10%胎牛血清（SBI去外泌體血清）+1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng)，所有細胞都在37 ℃、5%CO的條件下傳代培養(yǎng)，將處于指數(shù)生長期的細胞用作后續(xù)實驗。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機（HITACHI）；超高速冷凍離心機Optima XPN-100（BECKMAN）；ABI7500型實時熒光定量PCR儀（Thermo）；熒光倒置顯微鏡TE2000-Nikon公司）；Jem-1400型透射電子顯微鏡（Jeol）。

1.3 主要試劑

將收集的細胞上清液通過2000離心30 min，取上清液再用10 000離心45 min，再取其上清液用0.22 μm過濾器過濾；過濾后的上清液用超高速（130 000）離心兩次，70 min/次，棄掉上清液，外泌體沉淀用PBS重懸（一般情況，100 mL細胞培養(yǎng)上清液提取的外泌體用100 μL的PBS緩沖液重懸）。收集的外泌體可直接用于后續(xù)實驗，或置-80 ℃冰箱保存1月。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

分別將Opti-MEN基礎(chǔ)培養(yǎng)基、5 μmol/L FZD10-siRNA和轉(zhuǎn)染試劑按照表1的體積混合，并按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將FZD10-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染入95D、H1299細胞，并設(shè)轉(zhuǎn)染對照組。

1.5 外泌體提取

兔抗人PI3K 抗體、兔抗人p-PI3K 抗體、兔抗人GAPDH抗體、兔抗人YAP/TAZ抗體、兔抗人p-YAP抗體、兔抗人CD9 抗體、兔抗人Grp94 抗體（CST）；FZD10-siRNA 系列試劑及轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECTTransfection Reagents-SiRNA（Thermo）；angiogenesis assay kit ECM 62（Chemicon Millipore)；Angiopoietin-1 (Ang-1) human ELISA kit（RD）；VEGFA Human ELISA Kit、小鼠抗人CD81抗體、兔抗人FZD10抗體、兔抗人TSG101（Abcam）；PKH26紅色熒光染料（Sigma）；兔抗人Erk1/2抗體、兔抗人p-Erk1/2抗體、羊抗兔IgG、HRP標記抗體、DAPI染料、裂解液RIPA、Trizol（碧云天生物科技公司）；Matrigel基質(zhì)膠（BD）；SBI 去外泌體血清（艾博瑞生物科技公司）；SYBRPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）和PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）。

1.6 外泌體形態(tài)觀察

取10 μL外泌體懸液滴入銅網(wǎng)，室溫靜置3 min，用等體積的2%醋酸雙氧鈾染液染色2 min，晾干30 min，使用電壓80 kV的JEM-1400型透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)，并用Gatan832 CCD相機拍照保存。

1.7 外泌體內(nèi)化

將95D、H1299、BEAS-2B 細胞外泌體分別和PKH26染料混勻，室溫下避光靜置5 min，加入等體積的10%BSA終止反應(yīng)；再重新提取已標記的外泌體并重懸，將標記的外泌體與貼壁的HUVEC細胞共培養(yǎng)6 h，用4%多聚甲醛固定；再用DAPI染料進行細胞核染色，37 ℃溫箱中靜置10 min，在避光條件下，用熒光顯微鏡觀察外泌體被細胞內(nèi)化的情況。

1.8 體外成管實驗

用Trizol分別裂解95D、H1299、BEAS-2B細胞及不同細胞來源的外泌體預(yù)處理的HUVEC，提取總RNA，測定/，通過該比值判斷RNA樣品的純度并計算所提取樣品的RNA 濃度，計算公式為：C=×0.33×2000 μg/mL。將純度符合要求（/為1.8～2.0）的樣品，按照說明書進行去基因組DNA后，在ABI7500擴增儀上進行RT-qPCR反應(yīng)。擴增引物序列見表2，所有引物全部由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。逆轉(zhuǎn)錄（RT）條件：37 ℃15 min、85 ℃5 s；qPCR反應(yīng)條件：42 ℃5 min、95 ℃10 s,緊接著40個循環(huán)（95 ℃5 s、60 ℃31 s）。結(jié)果通過2值對擴增產(chǎn)物進行相對定量分析，將GAPDH作為內(nèi)參對照。

1.9 Western blot

定向越野運動能促進學(xué)生全面發(fā)展，在身體條件上提高學(xué)生的長跑能力，在心理上提高學(xué)生的耐力及團隊合作能力，從而使其在畢業(yè)時能更快地適應(yīng)社會。

本研究有一定的局限性需要指出。研究收錄部分老年患者，這些人存在二尖瓣退行性變的風(fēng)險。血流頻譜E/A作為判斷左心室舒張功能不全的指標存在假陰性的可能，不能完全確定患者心臟的舒張功能。另外本研究連續(xù)選取完成睡眠呼吸檢測和超聲心動圖的患者，入選過程可能存在偏倚。例如臨床出現(xiàn)心力衰竭癥狀的患者更容易被建議接受超聲檢查；因此入選的研究對象心力衰竭診斷率高于普通住院患者，研究結(jié)果難以推廣到一般人群。同時，由于接受睡眠呼吸檢測的患者多已被疑診睡眠呼吸紊亂，因此研究對象SA檢出率過高也限制了研究結(jié)論的推廣。

1.10 RT-qPCR

根據(jù)Chemicon（Millipore）的angiogenesis assay kit說明書操作。主要步驟：將基質(zhì)膠放在4 ℃冰箱過夜融化并按照10×稀釋液:基質(zhì)膠=1∶9的比例稀釋，用預(yù)冷的移液器取50 μL的基質(zhì)膠包被96孔板，靜置1 h使其凝固；預(yù)先按照2×10/孔將HUVEC細胞接種在六孔板中，用50 μg不同細胞來源的外泌體（NSCLC細胞、FZD10敲低的NSCLC細胞來源的外泌體）分別處理HUVEC 細胞48 h，消化、重懸后以細胞總數(shù)為8000～10 000且細胞懸液體積不超過150 μL的HUVEC細胞接種到已凝固的基質(zhì)膠上，培養(yǎng)6～8 h，于倒置顯微鏡下觀察成管情況，使用軟件Scion Image分析結(jié)果并計算成管總長度。

1.11 ELISA實驗

按照說明書，采用ELISA 法檢測NSCLC 細胞、FZD10敲低的NSCLC細胞來源的外泌體分別處理后的HUVEC條件培養(yǎng)基中VEGFA和Ang-1的濃度，檢測前需稀釋樣品到合適濃度，再在波長450 nm的分光光度計中讀取吸光度值，使用軟件ELISA CALC分析數(shù)據(jù)并計算濃度值。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，采用超速離心法所分離的物質(zhì)為單個或聚集成團的膜性結(jié)構(gòu)囊泡，呈現(xiàn)較典型的外泌體形態(tài)特征（圖1A）；利用Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，外泌體相關(guān)標志物CD81、CD9和TSG101均可在所提取的物質(zhì)中表達，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶相關(guān)蛋白Grp94（非外泌體相關(guān)標志物）卻不存在于所提取的物質(zhì)中（圖1B）。說明本研究利用超速離心法從細胞上清液中分離出的物質(zhì)是外泌體。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定

使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗都重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多組組間兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗。＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

使用強RIPA分別裂解細胞及其外泌體，提取總蛋白，使用BCA法檢測蛋白原液濃度，再加熱變性（CD81無需加熱變性），除Erk1/2、p-Erk1/2分析取12 μg外，其余取50 μg上樣、電泳（60 V濃縮30 min，再100 V電泳約1.5 h）、轉(zhuǎn)膜、電轉(zhuǎn)（100 V電轉(zhuǎn)1.5 h）、封閉。加入一抗4 ℃孵育過夜（除兔抗人Erk1/2抗體和兔抗人p-Erk1/2抗體按1∶2000稀釋外，其他一抗均按1∶1000稀釋），洗滌后，再加入二抗室溫孵育1～2 h（二抗全部按1∶2000稀釋）。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測信號，條帶結(jié)果用Image J軟件進行灰度值分析。將GAPDH作為內(nèi)參對照。

2.2 FZD10在NSCLC細胞及其外泌體中的表達

Western blot結(jié)果顯示，與BEAS-2B細胞及其外泌體相比較，95D、H1299細胞中的FZD10蛋白水平升高（＜0.01），且兩株NSCLC細胞來源的外泌體中也均有FZD10蛋白的高表達（圖2A、B）；RT-qPCR結(jié)果顯示，兩株NSCLC細胞中的FZD10 mRNA表達也高于對照細胞BEAS-2B（＜0.01，圖2C）。

2.3 NSCLC細胞來源的外泌體促進體外血管生成

外泌體內(nèi)化結(jié)果顯示，被標記的外泌體基本繞HUVEC細胞核單個或多個分布（圖3），HUVEC均可內(nèi)化95D、H1299和BEAS-2B三種細胞來源的外泌體；體外成管實驗結(jié)果顯示：與BEAS-2B細胞來源的外泌體處理組相比較，95D、H1299 兩株NSCLC 細胞來源的外泌體處理組的HUVEC總管長度明顯增加（＜0.01，圖4A、B）。ELISA檢測和RT-qPCR分別從蛋白水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平證實，95D、H1299兩株NSCLC細胞來源的外泌體明顯促進了HUVEC 中的血管生成相關(guān)標志物VEGFA 和Ang-1 的蛋白分泌和mRNA 表達（＜0.01，圖4C～E）。

與95D exo對照組比較，95D FZD10-KD exo處理組p-PI3K和p-Erk1/2的表達明顯下調(diào)（＜0.05，圖6A）；與H1299 exo對照組比較，H1299 FZD10-KD exo處理組p-PI3K和p-Erk1/2的表達降低（＜0.05，圖6B）。但YAP/TAZ信號通路相關(guān)分子表達差異不顯著（＜0.05，圖6）。

2.4 NSCLC細胞來源的外泌體通過FZD10促進體外血管生成

FZD10表達在95D、H1299細胞中被成功敲低（圖5A），F(xiàn)ZD10敲低的NSCLC 細胞來源的外泌體處理組（95D FZD10-KD exo、H1299 FZD10-KD exo）的HUVEC成管能力與FZD10未敲低的NSCLC細胞來源的外泌體處理組（95D exo、H1299 exo）相比明顯降低，兩組結(jié)果的總管長度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01，圖5B、C）。ELISA的檢測結(jié)果顯示：與95D exo處理組比較，95D FZD10-KD exo處理組的細胞條件培養(yǎng)液中血管生成相關(guān)標志物VEGFA和Ang-1濃度均明顯降低（＜0.01，圖5D、E）。RT-qPCR 的結(jié)果也顯示，95D FZD10-KD exo處理組細胞的VEGFA和Ang-1 mRNA表達水平也明顯低于95D exo處理組（＜0.01，圖5F）。

2.5 NSCLC細胞外泌體源性FZD10促進血管生成的分子機制

1.在我國經(jīng)濟發(fā)展日益成熟的今天，特別是我國參與國際貿(mào)易活動且不斷深化之后，知識經(jīng)濟作為一種大的國際環(huán)境，已然發(fā)展成為當(dāng)前企業(yè)在構(gòu)建現(xiàn)代化經(jīng)濟體系時所需要的重要資源。那些掌握了知識經(jīng)濟的企業(yè)，在國際市場上占據(jù)了領(lǐng)頭地位。這些企業(yè)只需要向其他企業(yè)出口知識或者專利，就能獲取高額收益，而那些使用這些知識資源的企業(yè)，也僅僅是在掙份辛苦錢。不僅如此，在未來，隨著信息化、智能化的進一步成熟，知識在未來社會發(fā)展過程中的地位將會更加牢固，有了知識技術(shù)優(yōu)勢的企業(yè)，將會更有優(yōu)勢。而那些知識信息嚴重匱乏的企業(yè)，將更加難以生存。

3 討論

外泌體是由體內(nèi)多種活細胞分泌的直徑在30～150 nm的細胞外囊泡，其可作為細胞間通訊的重要橋梁，在NSCLC生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、耐藥等中起重要作用，而且還發(fā)現(xiàn)外泌體可參與調(diào)控NSCLC血管生成。FZD10是經(jīng)典通路Wnt/βcatenin中的重要受體，其為影響腫瘤治療效果的關(guān)鍵分子，可能為腫瘤防治的重要靶點。近年發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞株來源的外泌體通過遞送FZD10誘導(dǎo)了正常結(jié)腸上皮細胞株發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而且FZD10外囊泡血漿濃度還與結(jié)直腸癌和胃癌發(fā)展有關(guān)。這些報道說明FZD10可能可通過外泌體遞送在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用，但FZD10是否可通過外泌體遞送在NSCLC發(fā)展中發(fā)揮作用還未見文獻報道。

三是大力要求提高國家文化軟實力。文化軟實力集中體現(xiàn)一個國家基于文化而具有的凝聚力和生命力，以及由此產(chǎn)生的吸引力和影響力。習(xí)近平指出，提高國家文化軟實力，關(guān)系我國在世界文化格局中的定位，關(guān)系我國國際地位和國際影響力，關(guān)系“兩個一百年”奮斗目標和中華民族偉大復(fù)興中國夢的實現(xiàn)。據(jù)此，首先需要深化文化體制改革，推動文化事業(yè)和文化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，更好構(gòu)筑中國精神、中國價值、中國力量，夯實國家文化軟實力的根基。同時，也要“不忘本來、吸收外來、面向未來”，著力擴大中華文化影響，推進國際傳播能力建設(shè)，增強對外話語的創(chuàng)造力、感召力、公信力，講好中國故事，讓世界了解一個多面的透底的真實的中國。

本研究發(fā)現(xiàn)FZD10 不僅在NSCLC 細胞（95D 和H1299）中高表達，而且在其外泌體中也呈現(xiàn)高表達。與正常人支氣管上皮細胞BEAS-2B來源的外泌體相比較，95D 和H1299 細胞來源的外泌體可明顯促進HUVEC細胞管狀樣結(jié)構(gòu)的形成及血管生成相關(guān)因子VEGF、Ang-1的蛋白分泌和mRNA表達（＜0.01），說明NSCLC細胞（95D和H1299）來源的外泌體可促進血管生成；但FZD10敲低后，95D 和H1299細胞來源的外泌體對HUVEC 細胞管狀樣結(jié)構(gòu)的形成及VEGF、Ang-1的蛋白分泌和mRNA表達的影響也受到了抑制（＜0.01），說明FZD10可通過外泌體遞送介導(dǎo)NSCLC血管生成，從而在NSCLC發(fā)展中起重要作用。因此，F(xiàn)ZD10可能是NSCLC防治的潛在靶點。

為進一步探討外泌體源性FZD10在NSCLC血管生成的作用機制，本研究對PI3K、Erk1/2、YAP/TAZ多條信號通路進行了初步分析。最近有研究報道在結(jié)腸癌和胃癌中外泌體源性FZD10通過Erk1/2信號通路增強了Ki-67的表達。本研究結(jié)果也顯示，F(xiàn)ZD10敲低的95D和H1299細胞來源的外泌體可抑制PI3K、Erk1/2信號通路的激活，說明PI3K、Erk1/2信號通路可能參與了外泌體源性FZD10促進NSCLC血管生成的過程。有研究在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管生成中發(fā)現(xiàn)FZD10以Gα 12/13依賴的方式誘導(dǎo)了YAP/TAZ 的轉(zhuǎn)錄激活，但本研究在對FZD10敲低和未敲低95D和H1299細胞來源的外泌體YAP/TAZ及p-YAP表達的比較分析中，未發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ 信號通路參與外泌體源性FZD10 促進NSCLC血管生成過程的調(diào)控，我們的結(jié)果與中樞神經(jīng)系統(tǒng)模型結(jié)果的差異可能由于細胞種類的不同及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性所致。

數(shù)據(jù)顯示，2017年四川省完成地區(qū)生產(chǎn)總值3.70萬億元。其中，成都以1.39萬億元，占比達到37%，可謂遙遙領(lǐng)先。排行第二的綿陽GDP總量為2074.8億元，成為四川首個跨過2000億門檻的地級市。德陽、宜賓、南充則緊隨其后，逼近2000億大關(guān)。在“1500億”一檔的瀘州、達州、樂山差距并不大。

基于目前FZD10 在NSCLC 研究罕見，尤其是NSCLC細胞外泌體源性FZD10在血管生成中的研究在我們所能檢索的資料范圍之內(nèi)未見報道，本研究不僅明確了FZD10在NSCLC細胞及其外泌體中高表達，而且還發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞來源的FZD10通過外泌體遞送介導(dǎo)體外血管生成。本研究的優(yōu)勢是將FZD10與血管生成之間的作用通過外泌體將兩者聯(lián)系起來，可進一步闡明FZD10 在NSCLC 發(fā)展中的作用機制，并可為NSCLC防治潛在靶點FZD10的發(fā)現(xiàn)提供實驗依據(jù)。