基于MicroRNA探討針灸治療膿毒癥的作用機(jī)制

賈坤平，孫忠人，劉關(guān)平，裴思穎，蔡國(guó)鋒，伊思銳,劉 源,梁 群

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

膿毒癥是一種由宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，可導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙[1]，甚至是死亡率極高的多器官功能障礙綜合征(MODS)[2]，其發(fā)病率已達(dá)535人/10萬(wàn)人，住院死亡率高達(dá)25%～30%，是世界各地仍需攻克的一項(xiàng)艱巨任務(wù)[3]。膿毒癥的病情發(fā)展較快、預(yù)后較差和病死率較高，是重癥醫(yī)學(xué)難題之一。根據(jù)《膿毒癥全球負(fù)擔(dān)報(bào)告》，每年有4 900萬(wàn)人受到感染，導(dǎo)致1 100萬(wàn)人死亡，最常見的感染部位為肺部、尿路、腹腔和循環(huán)系統(tǒng)的原發(fā)感染[4]。中國(guó)是膿毒癥發(fā)生率與死亡率較高的地區(qū)，2018年流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)膿毒癥患者每年3 238萬(wàn)人，死亡率為66.7%[5]，高出全球平均水平。2020年《Lancet》最新數(shù)據(jù)顯示，全球因膿毒癥死亡人數(shù)占全球死亡總數(shù)的19.7%。膿毒癥成為威脅人類生命健康的重要病癥之一[6]。盡管膿毒癥的研究已日趨深化，臨床上不斷有更新?lián)Q代的抗生素投入使用，但至今膿毒癥的死亡率仍未見顯著下降。因此，中醫(yī)藥多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì)在膿毒癥的治療中日漸凸顯。本研究通過梳理和分析關(guān)于miRNA-膿毒癥、膿毒癥-針灸等相關(guān)理論和臨床研究，從微小RNA(MicroRNA,miRNA)視角出發(fā)為針灸治療膿毒癥提供新的治療靶點(diǎn)，為中醫(yī)針灸在急危重癥的臨床推廣和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 miRNA在膿毒癥診治中的作用

膿毒癥不僅是一個(gè)全身炎癥反應(yīng)或免疫紊亂的過程，更涉及到體內(nèi)多個(gè)器官功能的改變。如圖1[7]所示，在細(xì)胞和分子水平，膿毒癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)失衡、免疫功能紊亂、線粒體損傷、凝血機(jī)制受損、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)、自噬和其他病理生理過程，并最終導(dǎo)致器官功能障礙[7]，而miRNA在膿毒癥細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[8]。

miRNA是非編碼的短RNA，進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于動(dòng)植物中，其主要功能是特異性結(jié)合靶mRNA，抑制靶mRNA表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，在炎癥、免疫和不同的肺損傷中具有多種生物學(xué)功能。miRNA可多效性地面向100～1 000個(gè)基因，并在細(xì)胞或器官中以特異性的方式發(fā)揮作用。一種miRNA可以調(diào)節(jié)患者體內(nèi)的幾種生物通路。由于其敏感性、特異性和可及性，miRNA被認(rèn)為是一種理想的生物標(biāo)志物。有研究已經(jīng)對(duì)miRNA在膿毒癥中的作用進(jìn)行了研究，并證實(shí)了膿毒癥患者中特定miRNA及其靶點(diǎn)的改變[9]。許多研究表明[10]，多種miRNAs直接靶向腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)通路，這是膿毒癥中促炎過程的主要調(diào)節(jié)因子；此外，miRNAs通過靶向toll樣受體(TLR)/核因子-κB(Nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)信號(hào)通路在膿毒癥調(diào)控中發(fā)揮功能作用。其中，TLR4被細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)激活。因此，被認(rèn)為與膿毒癥最相關(guān),見圖2；同時(shí)，miRNA調(diào)控了膿毒癥相關(guān)基因的表達(dá)，如白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、TNF等，并被這些因子調(diào)控自身的表達(dá),見圖3[10]，凸顯了miRNA在膿毒癥病理生理中的深度整合。既往研究也證實(shí)了miRNA表達(dá)水平與膿毒癥患者死亡率之間的相關(guān)性[11]。尚有研究報(bào)道m(xù)iRNA可用于表明病理的存在，及其分期、進(jìn)展和不同疾病發(fā)病機(jī)制的遺傳聯(lián)系[12-15]。此外，miRNA水平的改變可以區(qū)分膿毒癥的不同病理階段[16]；尚可對(duì)處于不同病理生理階段的病人提供新穎有效的治療策略[17-19]。

1.1 miRNA在膿毒癥急性肺損傷中的作用

膿毒癥引起的急性肺損傷是膿毒癥最為嚴(yán)重的一種癥狀。研究表明過表達(dá)miR-574可抗凋亡活性，抑制炎癥反應(yīng)，抑制ERS作用；上調(diào)miR-574以減輕膿毒癥急性肺損傷可能是通過促進(jìn)補(bǔ)體C3下調(diào)和減輕ERS實(shí)現(xiàn)的[20]。膿毒癥時(shí)，循環(huán)中大量細(xì)胞受到刺激，如血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞等，隨后可分泌微泡(Microvesicles，MVs)，其中內(nèi)皮細(xì)胞MVs(Endothelial MVs,EMVs)通過轉(zhuǎn)運(yùn)功能性miR-23b在膿毒癥時(shí)肺血管滲漏和肺損傷中發(fā)揮重要作用，通過拮抗EMVs及其miR-23b的分泌，可減輕血管滲漏和肺損傷[21]。Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的miR-181a上調(diào)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin 1,SIRT1)下調(diào)，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2的表達(dá)，激活NF-κB通路；抑制miR-181a可減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和凋亡，這可能是通過上調(diào)其靶點(diǎn)SIRT1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。尚有研究表明環(huán)狀RNA circC3P1過表達(dá)可通過下調(diào)miR-21降低細(xì)胞凋亡和促炎細(xì)胞因子水平治療膿毒癥急性肺損傷[23]。

1.2 miRNA在膿毒癥急性心肌損傷中的作用

膿毒癥急性心肌損傷是導(dǎo)致膿毒癥死亡的主要原因，其發(fā)生機(jī)制可能與心肌細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙和細(xì)胞外炎癥浸潤(rùn)等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miR-132-3p通過抑制髓樣分化蛋白88/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)抗膿毒癥心肌損傷的作用[24]。

1.3 miRNA在膿毒癥急性腎損傷中的作用

急性腎損傷作為膿毒癥常見合并癥之一，會(huì)加重膿毒癥病情，甚至增加病死率，而腎小管上皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是引起膿毒癥急性腎損傷的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a通過靶向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)減輕膿毒癥腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡[25]。此外，1項(xiàng)162例膿毒癥并發(fā)急性腎損傷患者的隨機(jī)對(duì)照觀察顯示，miR-146a與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，對(duì)預(yù)測(cè)該類患者的28 d死亡率有較高價(jià)值[26]。此外，miR-15a-5p、miR-192-5p、miR-155-5p、miR-486-5p和miR-423-5p均被證實(shí)是膿毒癥急性腎損傷的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[27]。

1.4 miRNA在膿毒癥肝損傷中的作用

膿毒癥并發(fā)肝損傷是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其機(jī)制可能為微循環(huán)低灌注、缺血缺氧性損傷和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等[28]。miR-122a參與膿毒癥肝損傷患者的損傷過程，是評(píng)估膿毒癥肝損傷預(yù)后和死亡的敏感指標(biāo)之一[29]。

2 針灸治療膿毒癥的研究進(jìn)展

針灸療法在膿毒癥的治療中具有積極作用，該作用并不在于直接殺菌、滅毒，而在于對(duì)炎癥反應(yīng)及免疫功能的調(diào)節(jié)和對(duì)多器官功能的保護(hù)。研究表明[30]，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互協(xié)調(diào)對(duì)于炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)十分重要，而對(duì)“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)系統(tǒng)”的積極調(diào)節(jié)作用是針灸抗炎的關(guān)鍵生物學(xué)基礎(chǔ)。炎性反應(yīng)信息由迷走神經(jīng)傳入中樞(相關(guān)腦區(qū)主要有迷走背核、孤束核等)，加工整合后，再下行至植物神經(jīng)系統(tǒng)及下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)和控制炎性反應(yīng)。此外，針灸還具有雙向良性調(diào)節(jié)、飽和調(diào)節(jié)和多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，但這些優(yōu)勢(shì)又受到機(jī)體自穩(wěn)態(tài)機(jī)制對(duì)針灸干預(yù)的整合與利用的影響[31]。

席卷全球的新型冠狀病毒肺炎患者繼發(fā)全身性炎性反應(yīng)，出現(xiàn)膿毒癥休克是新型冠狀病毒重癥肺炎的重癥并發(fā)癥。2020年2月8日，中國(guó)針灸學(xué)會(huì)發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎針灸干預(yù)的指導(dǎo)意見》，推薦疑似病例、輕癥和普通型患者以及恢復(fù)期患者使用灸法治療[32]。此外，有大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明針灸可以治療炎性反應(yīng)性疾病，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)亦驗(yàn)證了針灸治療膿毒癥的確切療效。而且已經(jīng)證實(shí)，針灸尤其是電針治療膿毒癥的作用機(jī)制是激發(fā)迷走抗炎途徑及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[33]。

2.1 針灸對(duì)炎癥反應(yīng)的影響

針灸療法對(duì)膿毒癥患者的炎性因子具有調(diào)節(jié)作用。電針足三里穴可降低膿毒癥患者急性生理與慢性健康評(píng)分(Acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHEⅡ)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、降鈣素原(Procalcitonin,PCT)和血清乳酸，升高CD4+、CD8+含量，可調(diào)節(jié)體內(nèi)抗炎與促炎反應(yīng)趨向平衡，從而降低MODS的發(fā)生率和病死率，改善膿毒癥預(yù)后，其機(jī)制可能與電針足三里減少體內(nèi)促炎和抗炎介質(zhì)釋放有關(guān)[34]。1項(xiàng)108例的大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(Randomized controlled trial,RCT)發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，接受針刺足三里3 d治療的膿毒癥患者，炎性反應(yīng)因子血清PCT、血乳酸、APACHEⅡ評(píng)分及全身性感染相關(guān)器官功能衰竭評(píng)分(SOFA)等相關(guān)指標(biāo)均顯著降低[35]。結(jié)合筆者及團(tuán)隊(duì)的前期臨床研究表明，電針可降低氣管切開插管患者臨床肺部感染評(píng)分，促進(jìn)肺部感染的恢復(fù)[36]，改善肺部的換氣功能[37]；前期實(shí)驗(yàn)研究表明[38]，電針可降低基底節(jié)腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷陌准?xì)胞計(jì)數(shù)，改善肺部的組織病理形態(tài)，均說明電針具有一定的抗炎作用。

2.2 針灸對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)

膿毒癥的致病機(jī)制復(fù)雜，其中免疫調(diào)節(jié)失衡是其重要原因。因此，及時(shí)改善免疫抑制是膿毒癥的治療重點(diǎn)。針灸療法能夠明顯改善膿毒癥患者的免疫功能，升高CD3+、CD4+、CD8+、IgG、IgA及IgM含量，縮短ICU住院時(shí)間，降低再次住院率及28 d病死率[39]。

2.3 針灸對(duì)多器官功能的保護(hù)

針灸療法對(duì)于膿毒癥患者的胃腸功能具有積極的保護(hù)作用，可改善腹腔內(nèi)壓、胃殘余量[40]。2019年的1項(xiàng)大樣本RCT試驗(yàn)比較了118例膿毒癥胃腸功能障礙患者接受針刺治療的療效差異，發(fā)現(xiàn)在第6天和第10天針刺組胃腸功能障礙評(píng)分、炎性反應(yīng)指標(biāo)計(jì)數(shù)均明顯低于對(duì)照組，針刺治療可明顯改善腸道通透性及血液循環(huán)，有助于早期實(shí)現(xiàn)目標(biāo)喂養(yǎng)[41]。

此外，電針能顯著抑制膿毒癥大鼠心肌炎性反應(yīng)促炎因子的水平發(fā)揮心肌保護(hù)作用[42]。電針百會(huì)、水溝穴能有效改善膿毒癥相關(guān)性腦病患者的腦損傷，提高臨床療效[43]。

電針還可以通過激活PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)血紅素加氧酶的表達(dá)，從而抑制促炎因子的釋放、減少中性粒細(xì)胞的聚集，來減輕內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷時(shí)的炎性反應(yīng)，達(dá)到肺保護(hù)的作用[44]。電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)、足三里穴可通過Janus蛋白酪氨酸激酶1/STAT3通路減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷，抑制膿毒癥大鼠炎性介質(zhì)的釋放及細(xì)胞凋亡[45]。

3 miRNA在針灸治療膿毒癥中的作用機(jī)制

研究表明，電針可通過降低miRNA-133a改善膿毒癥心肌損傷患者APACHEⅡ評(píng)分、肌鈣蛋白，調(diào)節(jié)抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子caspase-3、TNF-α及IL-6，提高左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，起到保護(hù)心肌損傷作用[46]。電針尚可通過上調(diào)miR-146a激活膽堿能抗炎通路，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及高遷移率族蛋白-1水平，從而提升膿毒癥小鼠生存率，減輕全身炎癥反應(yīng)和臟器損傷[47]，效果顯著。

4 小結(jié)

膿毒癥隸屬于中醫(yī)外感發(fā)熱范疇[48]，因熱毒邪入營(yíng)血，瘀滯于脈，侵襲臟腑，氣血津液不足，不能濡養(yǎng)臟腑及四肢百骸，致臟腑精氣虛衰。針灸這一傳統(tǒng)治療手段在膿毒癥中的運(yùn)用不僅是對(duì)中華傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的繼承與發(fā)揚(yáng)，更為膿毒癥的治療開辟了新的方向。

針灸對(duì)機(jī)體生理、病理過程具有多系統(tǒng)、多臟器與多靶點(diǎn)的整體綜合性干預(yù)特點(diǎn)，在體內(nèi)可引起包括基因、蛋白與代謝等多個(gè)層面的反應(yīng)，是預(yù)防和治療膿毒癥的方法之一，而大量研究表明miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)影響膿毒癥相關(guān)信號(hào)通路，在膿毒癥的不同病理階段發(fā)揮重要生物學(xué)作用，是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵一員，也是目前很有前景的一類新的生物學(xué)標(biāo)志物，可作為判斷膿毒癥預(yù)后的新靶點(diǎn)，因此基于miRNA研究針灸在膿毒癥中的治療作用可能是闡明針灸治療膿毒癥作用機(jī)制的有效手段，借助基因組學(xué)的相關(guān)方法和技術(shù)，將有助于進(jìn)一步深入、系統(tǒng)地揭示針灸治療膿毒癥的分子生物學(xué)機(jī)制。

然而，目前從miRNA角度觀察針灸治療膿毒癥的報(bào)道不多。很多miRNAs均能在膿毒癥的診治中發(fā)揮作用，今后的研究可以多從這些方面入手，以針灸為干預(yù)手段觀察不同miRNA在膿毒癥中的變化，從而從基因水平為針灸領(lǐng)域的研究提供更多證據(jù)，以期進(jìn)一步明確針灸的作用機(jī)制。但仍有一些問題尚待解決。目前基于miRNA-膿毒癥的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞培養(yǎng)較多、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的在體實(shí)驗(yàn)較少，而研究針灸的作用機(jī)制勢(shì)必要在活體動(dòng)物上進(jìn)行操作，有關(guān)miRNA的抑制劑或生物類似物的體內(nèi)注入并沒有統(tǒng)一公認(rèn)的劑量規(guī)范，亦缺乏對(duì)miRNA的抑制劑或生物類似物的作用時(shí)效研究，對(duì)其死亡率及成功率尚未有明確的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。此外，基于針灸的一些基礎(chǔ)科學(xué)問題，比如針灸的干預(yù)方式、刺激量、穴位特異性、腧穴配伍及穴位敏化研究等，仍需進(jìn)行多中心、大樣本的隨機(jī)雙盲臨床觀察及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，增加可比性、可重復(fù)性，通過miRNA表達(dá)調(diào)控的研究等，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面更深入加強(qiáng)對(duì)針灸作用規(guī)律和物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)知，進(jìn)一步挖掘針灸的調(diào)控機(jī)制并發(fā)現(xiàn)治療膿毒癥的新靶點(diǎn)。

此外，膿毒癥不同的病理進(jìn)程及不同器官的功能損傷其介導(dǎo)的miRNA可能不盡相同，所采用的針灸干預(yù)方式及腧穴配伍選擇亦會(huì)有所差異，目前國(guó)內(nèi)外尚無統(tǒng)一的針灸治療膿毒癥的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，仍需借助基因數(shù)據(jù)庫(kù)等生物信息技術(shù)篩選并驗(yàn)證符合該病理階段及該器官功能的特征miRNA，并制定出特質(zhì)化的優(yōu)化方案，全程、動(dòng)態(tài)和全方位地把握針灸治療膿毒癥在不同時(shí)期、不同臟器的效應(yīng)規(guī)律和機(jī)制，并盡可能探索其內(nèi)在的相互作用關(guān)系，為針灸治療膿毒癥的臨床應(yīng)用及推廣提供堅(jiān)實(shí)可靠的科學(xué)依據(jù)。