高效液相色譜法直接測定谷丙甘氨酸膠囊中3種氨基酸的含量

陳 希, 鄢雷娜, 任 琦, 石青松, 段和祥*

(1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心,江西南昌 330029；2.南昌大學，江西南昌 330029)

氨基酸含量檢測多采用分光光度法、近紅外光譜法、高效液相色譜法[1,2]，其中分光光度法多用于單組分氨基酸含量或氨基酸總量的測定，且需要用茚三酮衍生化后再測定[3 - 5]；近紅外光譜法具有高效、無污染、不破壞樣品以及同時檢測多組分的優(yōu)點，但存在準確性差的缺點[6,7]；高效液相色譜法同時測定多組分氨基酸。一般需采用異硫腈酸苯酯(PITC)[8,9]、鄰苯二甲醛(OPA)[10,11]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[12,13]等衍生化試劑進行柱前衍生，存在衍生反應條件苛刻(PITC法)、衍生時間長(DNFB法)、衍生物不穩(wěn)定(OPA法)等缺點。而柱后衍生高效液相色譜法測定氨基酸需先用陽離子交換柱分離氨基酸，再與茚三酮或OPA柱后衍生成具有熒光或紫外吸收的物質后分析測定，需采用專門的氨基酸分析儀，價格偏貴[14,15]。

谷丙甘氨酸膠囊主要用于前列腺增生引起的尿頻、排尿困難、尿潴留等癥的治療。該藥物為復方制劑，含有谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸共3種氨基酸。谷丙甘氨酸膠囊標準收載于《中國藥典》2020年版二部，使用DNFB為衍生化試劑，柱前衍生后用HPLC法在360 nm波長下測定氨基酸的含量。該方法氨基酸需在堿性條件下與DNFB在60 ℃水浴中反應50 min，衍生化時間較長[16]。氨基柱是由極性基團氨丙硅烷基鍵合在硅膠上制成的極性鍵合色譜柱，主要用于分離極性大的物質，如糖類和氨基酸的分離，待測物質主要因氫鍵及范德華力的強弱實現(xiàn)分離。本研究采用HPLC法，使用氨基柱在210 nm波長下直接測定谷丙甘氨酸膠囊中3種氨基酸的含量，方法操作簡單，精密度、重復性和準確度良好。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-6AD高效液相色譜儀(日本，SHIMADZU公司)；MS205DU電子天平(瑞士，METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FE20K酸度計(瑞士，METTLER TOLEDO公司)。

L-谷氨酸對照品(批號：20210520，含量：98.5%)；L-丙氨酸對照品(批號：20210520，含量：98.5%)；甘氨酸對照品(批號：20180517，含量：100%)。對照品來源均為國藥集團化學試劑有限公司。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

谷丙甘氨酸膠囊，生產企業(yè)：天津金虹勝利藥業(yè)有限公司，批號：200903，規(guī)格：每粒含谷氨酸0.265 g、丙氨酸0.1 g、甘氨酸45 mg，平均裝量為0.410 g。

1.2 色譜條件

色譜柱為：Sharpsil氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：溶液A(20 mmol/L KH2PO4溶液(KH2PO42.72 g，加水1 L溶解后，加濃氨水5 mL，用H3PO4調節(jié)pH值至5.0))∶乙腈=45∶55(V/V)。流速：1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量50 μL；檢測波長：210 nm。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液精密稱取L-谷氨酸對照品102.08 mg、L-丙氨酸對照品39.08 mg和甘氨酸對照品17.68 mg，置于50 mL容量瓶中，加溶液A25 mL，超聲5 min使溶解后，再用乙腈稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液(含谷氨酸2 mg/mL、丙氨酸0.75 mg/mL和甘氨酸0.34 mg/mL)。精密吸取上述溶液5 mL于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻(約含谷氨酸約1 mg/mL、丙氨酸0.38 mg/mL和甘氨酸0.17 mg/mL)。

1.3.2 供試品溶液取谷丙甘氨酸膠囊內容物混勻，稱取約77 mg，置于50 mL容量瓶中，加溶液A 25 mL，超聲5 min使溶解后，再用乙腈稀釋至刻度，搖勻(含谷氨酸1 mg/mL、丙氨酸0.38 mg/mL和甘氨酸約0.17 mg/mL)。

2 結果與討論

2.1 流動相緩沖鹽種類的選擇

氨基柱一般作為正相柱使用，在分析氨基酸時分離模式采用親水作用色譜(HILIC)模式，流動相常用乙腈和水。本研究分別以溶液A、溶液B(20 mmol/L NH4H2PO4(氨水調節(jié)pH值至5.0))和溶液C(50 mmol/L NH4H2PO4(氨水調節(jié)pH值至5.0))為鹽相，與乙腈混合作為流動相(其中乙腈占55%)，考察不同鹽相對氨基酸的分離效果。結果采用溶液B時，谷氨酸峰出峰較晚且峰形較差。采用溶液C時，樣品和對照品中雜質峰均與甘氨酸峰重疊。而采用溶液A時，雜質峰與丙氨酸峰實現(xiàn)基線分離，分離度Rs達到3.5，且谷氨酸峰理論板數(shù)N高達11 000，結果見圖1。最終選擇溶液A為鹽相。

圖1 不同緩沖溶液中對照品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substance in different buffer solutionA:20 mmol/L KH2PO4(pH 5.0)∶ACN=45∶55(V/V);B:20 mmol/L NH4H2PO4(pH 5.0)∶ACN=45∶55(V/V);C:50 mmol/L NH4H2PO4(pH 5.0)∶ACN=45∶55(V/V).1.Alanine;2.Glycine;3.Glutamic;4.Impurity.

2.2 溶液A的pH值優(yōu)化

氨基柱在HILIC模式使用時最適pH范圍是3～7，在此pH范圍外會導致色譜柱上的-NH2加速水解，色譜柱壽命會很快下降。為延長色譜柱使用壽命，本研究僅選擇pH=4～6作為流動相pH考察范圍。將溶液A分別用磷酸調節(jié)pH至4.0、5.0和6.0，考察不同pH時3種氨基酸的分離效果。pH=4.0時，雜質峰與丙氨酸峰重疊；pH=6.0時，3種氨基酸出峰較快，谷氨酸峰形變差理論板數(shù)下降到8 600，見圖2。pH=5.0時，雜質峰和丙氨酸峰完全分離，且谷氨酸峰理論板數(shù)最高，見圖1A。綜合優(yōu)選溶液A用磷酸調節(jié)pH值為5.0。

圖2 不同pH值對照品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of reference substance at different pHA.pH=4.0;B.pH=6.0.1.Alanine;2.Glycine;3.Glutamic;4.Impurity.

2.3 乙腈比例的優(yōu)化

調節(jié)流動相中乙腈比例為50%、55%和60%，考察不同比例乙腈時3種氨基酸的分離效果。結果乙腈比例為50%時，3種氨基酸出峰較快，且雜質1峰與丙氨酸峰重疊。而乙腈比例為60%時，雜質1峰與丙氨酸峰完全分離，谷氨酸理論板數(shù)與55%乙腈時近似，但谷氨酸出峰時間較晚，整體分析時間延長。綜合優(yōu)選流動相中乙腈比例為55%。

2.4 對照品和供試品溶液制備方法選擇

按“1.3”的方法稱取對照品和供試品，分別加25 mL溶液A和流動相超聲溶解，考察兩種方法對照品和供試品溶解所需時間。采用溶液A超聲溶解時間在5 min以內，采用流動相超聲溶解時間在20～25 min。氨基柱在HILIC模式使用時，待測溶液如全部為水溶液，會導致峰形較差，一般加入適量乙腈以減少溶劑效應以改善峰形。最終選擇先加50%溶液A超聲溶解對照品和供試品后，再用乙腈稀釋的方法制備對照品和供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系、定量限與檢出限按“1.2”，分別吸取對照品儲備溶液5、10、25、50、75和100 μL進樣，以各氨基酸峰面積為縱坐標(y)、各氨基酸質量(x)為橫坐標，進行線性回歸。取對照品溶液適量，用流動相稀釋成含谷氨酸分別為2.4、3.6、8、12、40 μg/mL的對照品，分別按“1.2色譜條件”測定。以各組分信噪比分別滿足3∶1作為檢出限(LOD)，滿足10∶1作為定量(LOQ)限。線性回歸方程、檢出限和定量限見表1。3種氨基酸線性方程的相關系數(shù)均為0.9999，線性關系良好。

表1 3種氨基酸的標準曲線、相關系數(shù)、精密度、檢出限和定量限

2.5.2 精密度和穩(wěn)定性取對照品溶液，按“1.2”連續(xù)進樣6次(50 μL)，記錄色譜圖。計算各氨基酸峰面積的相對標準 偏差(RSD)均為0.2%，說明本方法精密度良好。取供試品溶液(稱樣量77.02 mg)，在0、2、4、8、24 h按“1.2色譜條件”測定，結果3種氨基酸峰面積RSD均小于0.2%，表明3種氨基酸在24 h內穩(wěn)定。

2.5.3 樣品測定重復性制備6份供試品溶液，按“1.2色譜條件”分析，記錄色譜圖。以精密度中對照品溶液測定數(shù)據(jù)以外標法計算樣品中氨基酸的含量(按標示量計算)，丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的平均含量分別為95.24%、98.89%和96.59%，RSD(n=6)分別為0.9%、1.0%和0.8%，說明本方法重復性良好。

2.5.4 準確度稱取丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸對照品78.56 mg、35.75 mg和204.2 mg，置于200 mL容量瓶中，加溶液A約100 mL，超聲5 min使溶解，再用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為回收對照品溶液。取谷丙甘氨酸膠囊內容物約308 mg，置于200 mL容量瓶中，加溶液A約25 mL，超聲5 min使溶解，再用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為回收樣品溶液(制備6份)。分別精密吸取上述兩種溶液各25mL，置于50 mL容量瓶中，搖勻，作為回收測定溶液，按“1.2色譜條件”測定，計算回收率。結果3種氨基酸加樣回收率均在98.58%～100.32%之間，且RSD均小于0.6%，說明本方法準確度良好，數(shù)據(jù)見表2。

表2 回收率實驗結果

3 結論

本研究建立用氨基色譜柱HPLC法直接測定谷丙甘氨酸膠囊中3種氨基酸含量的方法，通過優(yōu)化流動相中鹽相種類、pH、有機相比例等參數(shù)，得到最佳流動相組成。研究證實先用50%溶液A超聲溶解樣品再用乙腈稀釋的方法制備供試品溶液，比只用流動相溶解樣品的方法節(jié)省15 min以上的超聲時間，且供試品溶液非常穩(wěn)定。使用氨基柱采用HPLC法在210 nm波長下可直接測定分析上述3種氨基酸。本方法操作簡單快捷、經濟實用，且線性、精密度和準確度良好，可用于谷丙甘氨酸膠囊中3種氨基酸含量的測定。