QuEChERS-氣相色譜/質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的殘留量

張 仙， 胡西洲， 張雋嫻

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064)

氟蟲(chóng)腈(Fipronil)又名芬普尼、銳勁特，它是法國(guó)羅納普朗克公司于1981開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的一種高活性且應(yīng)用廣泛的苯基吡唑類(lèi)光譜殺蟲(chóng)劑[1]。氟蟲(chóng)腈可通過(guò)氧化還原和水解過(guò)程降解，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈硫醚。氟蟲(chóng)腈代謝物在人體中的保留時(shí)間比母體更長(zhǎng)，毒性更強(qiáng)[2,3]，人食用含有一定濃度的氟蟲(chóng)腈食品，會(huì)損傷腎臟和肝臟，世界衛(wèi)生組織將其列為“對(duì)人類(lèi)有中度毒性”的化學(xué)品[4]。氟蟲(chóng)腈及其代謝物對(duì)環(huán)境及人類(lèi)健康的影響受到了很多國(guó)家的關(guān)注，并對(duì)其使用及殘留量作出了明確規(guī)定，歐盟和日本規(guī)定了牛奶中氟蟲(chóng)腈的限量值分別為0.005和0.02 mg/kg[5,6]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2021)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了牛奶中氟蟲(chóng)腈最大殘留限量為0.02 mg/kg[7]，但此標(biāo)準(zhǔn)并未規(guī)定氟蟲(chóng)腈的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)也尚未制定乳制品中氟蟲(chóng)腈殘留量檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

目前，氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[8,9]、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[10]、液相色譜法[11]和液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法[12,13]。但這些檢測(cè)方法主要是針對(duì)氟蟲(chóng)腈原藥、植物源性產(chǎn)品、環(huán)境水體中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留檢測(cè)，采用氣相色譜/質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶基質(zhì)中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物的相關(guān)報(bào)道較少。張小剛等[14]建立了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的分析方法；王永芳等[15]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量；羅彤等[16]利用氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜(GC-NCI-MS)測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物殘留量等。本實(shí)驗(yàn)將QuEChERS法與氣相色譜/質(zhì)譜法相結(jié)合，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的分析方法。該方法通過(guò)將合適的固體吸附劑加入樣品提取液中，達(dá)到除去基質(zhì)中的干擾物和對(duì)目標(biāo)組分的提取和凈化的目的，具有簡(jiǎn)單快速、試劑用量小、檢測(cè)范圍廣、高效等優(yōu)點(diǎn)，可滿(mǎn)足快速處理大批量農(nóng)藥殘留樣品的需求。為牛奶中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 6890A-5975C型氣相色譜/質(zhì)譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，配備電子轟擊源(EI)；CMVC渦旋振蕩儀(德國(guó)，Sartorius股份公司)；BSA2202S型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督測(cè)試中心，質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL。甲醇、乙腈、丙酮(色譜純，美國(guó)Baker公司)；無(wú)水MgSO4、無(wú)水NaAc(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N-丙基乙二胺填料PSA購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

牛奶購(gòu)于便利超市。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取準(zhǔn)確稱(chēng)取15.00 g(精確至0.01 g)牛奶樣品于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL冰HAc-乙腈溶液，渦旋振蕩3 min，水浴超聲提取20 min，加入6.0 g無(wú)水MgSO4和1.5 g無(wú)水NaAc，渦旋混勻2 min后，5 000 r/min離心3 min。

1.2.2 凈化準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g PSA、0.75 g無(wú)水MgSO4置于10 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確吸取5.0 mL上清液至此離心管中，渦旋振蕩2 min，以5 000 r/min離心3 min。取1 mL上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜后，供氣相色譜/質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱，DB-5MS毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；色譜柱溫度程序：90 ℃保持1 min，然后以12 ℃程序升溫至290 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度320 ℃；色譜/質(zhì)譜接口溫度270 ℃；載氣，氦氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲，11.0 min。

質(zhì)譜條件：EI源，70 eV；離子源溫度260 ℃。SIM模式：每個(gè)化合物選擇1個(gè)定量離子和2個(gè)定性離子，4種化合物的保留時(shí)間、母離子、子離子見(jiàn)表1。氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品先用丙酮稀釋至100 μg/mL，保存于-18 ℃冰箱內(nèi)，再分別用空白牛奶基質(zhì)溶液配制成 0.010 0、0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.500 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的保留時(shí)間、母離子和子離子

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于氟蟲(chóng)腈及其代謝物屬于弱極性的化合物，在不同的有機(jī)溶劑中有著不同的溶解度，本實(shí)驗(yàn)選用了甲醇，乙腈，1%酸化乙腈為提取溶劑，在陰性牛奶樣品中添加氟蟲(chóng)腈及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.01 mg/kg，按照“1.2”進(jìn)行提取凈化，“1.3”進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。可以看出當(dāng)使用甲醇作為提取溶劑時(shí)，4種化合物的回收率僅為26.4%～47.7%；使用純乙腈提取時(shí)，4種化合物的平均提取率僅為78.4～80.6%；1%酸化乙腈提取時(shí)，回收率均可達(dá)到83.0%以上。這可能是由于氟蟲(chóng)腈及其代謝物屬于弱堿性化合物，更易溶于酸性溶劑，且乙腈的極性強(qiáng)，有沉淀樣品中蛋白質(zhì)作用，能減少脂肪及其他雜質(zhì)的溶出從而減少了基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾。本實(shí)驗(yàn)選用1%酸化乙腈作為提取溶劑。4種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2?？梢钥闯?，氟蟲(chóng)腈及其代謝物均有較高的響應(yīng)強(qiáng)度，且分離效果良好。

圖1 3種提取溶劑對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effects of three extraction solvent on the recovery of the fipronil and its metabolites

圖2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of fipronil and its metabolites1.Fipronil desulfinyl,2.Fipronil sulfide,3.Fipronil,4.Fipronil sulfone.

2.2 凈化條件的優(yōu)化

牛奶基質(zhì)中主要成分是水，還含有很多脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、乳糖等成分，這些物質(zhì)的存在會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)過(guò)乙腈提取后需通過(guò)凈化去除這些雜質(zhì)的干擾，才能使得目標(biāo)物分離的更好，同時(shí)也能減少雜質(zhì)對(duì)儀器的污染。結(jié)合牛奶基質(zhì)特性以及氟蟲(chóng)腈類(lèi)化合物的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)比較了Florisil固相萃取柱、氨基-石墨化炭黑復(fù)合柱和經(jīng)典的QuECHERS法對(duì)樣品的凈化，對(duì)加標(biāo)0.1 mg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的牛奶提取液進(jìn)行凈化比較回收率，從回收率高低、凈化所需時(shí)間、耗材的成本進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示Florisil固相萃取柱回收率偏低，QuEChERS法和氨基-石墨化炭黑復(fù)合柱的回收率相當(dāng)，但氨基-石墨化炭黑復(fù)合柱操作過(guò)程復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)且活化洗脫柱子耗費(fèi)有機(jī)試劑較多對(duì)環(huán)境污染較大，而QuEChERS法操作過(guò)程簡(jiǎn)單快速且回收率能到到要求，綜合以上考慮，選用QuECHERS法對(duì)提取液進(jìn)行凈化。三種凈化方法的回收率結(jié)果如圖3所示。

圖3 牛奶中氟蟲(chóng)腈及其代謝物不同凈化方式的回收率Fig.3 Recoveries of fipronil and its metabolites in milk by different purification methods

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線(xiàn)性范圍和方法檢出限依次測(cè)定0.01、0.10、0.15、0.20、0.50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以氟蟲(chóng)腈及其代謝物的峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x)繪制其線(xiàn)性工作曲線(xiàn)，這4種農(nóng)藥在0.01～0.50 μg/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.997。0.01 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以3倍和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表2。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢出限為0.30～0.68 μg/kg，定量限為0.90～1.20 μg/kg。

表2 4種化合物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)

2.3.2 方法回收率和精密度取15.00 g 陰性牛奶樣品，添加0.010、0.100、0.500 mg/kg 3個(gè)水平的氟蟲(chóng)腈及其代謝物，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣，按照“1.2”進(jìn)行樣品前處理，按“1.3”進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。4種化合物平均回收率在83.7%～112.6%，精密度RSD在1.8%～4.2%，均滿(mǎn)足國(guó)標(biāo)(GB/T 27404-2008)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》對(duì)方法技術(shù)參數(shù)的要求。

表3 加標(biāo)牛奶中4種化合物的平均回收率和RSD(n=6)

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察樣品在分析過(guò)程中，受基質(zhì)效應(yīng)的影響，目標(biāo)化合物會(huì)發(fā)生離子增強(qiáng)或減弱效應(yīng)，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率考察不同化合物的基質(zhì)效應(yīng)，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小[17]。比較純?nèi)軇┍团Ｄ袒|(zhì)空白配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的基質(zhì)效應(yīng)，氟蟲(chóng)腈及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)在98.7%～106.3%之間。說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)的凈化方法具有較好的凈化效果。為了更準(zhǔn)確的測(cè)定目標(biāo)化合物降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量測(cè)定。

2.4 方法比較

將本實(shí)驗(yàn)所建立的QuEChERS-氣相色譜/質(zhì)譜法與目前已有的關(guān)于乳制品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法[14 - 16]進(jìn)行比較，包括提取溶劑、凈化方法、檢出限、平均回收率等。結(jié)果如表5所示，相比其他方法，本方法的檢出限與文獻(xiàn)報(bào)道的LC-MS/MS檢測(cè)方法相當(dāng)，且操作簡(jiǎn)單快速，樣品前處理過(guò)程中所需試劑和耗材較少，成本低污染小，具有良好的操作性和實(shí)用性。

表5 與已有其他方法的比較

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)上 30個(gè)牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定，所有樣品均未檢出氟蟲(chóng)腈及其他三種代謝物。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)利用QuEChERS前處理方法，結(jié)合GC/MS，建立了針對(duì)牛奶中氟蟲(chóng)腈及其他三種代謝物殘留的檢測(cè)方法，并對(duì)提取條件、凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)及方法學(xué)進(jìn)行了考察。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法的回收率、精密度、線(xiàn)性、定量限、檢出限等均滿(mǎn)足農(nóng)藥多殘留檢測(cè)技術(shù)的要求。該方法提取效率高、凈化速度快、前處理簡(jiǎn)單快速、易于操作，可大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，適合大批量樣品的快速篩查；檢測(cè)成本低，不需要固相柱凈化，節(jié)省了耗材及試劑；整個(gè)過(guò)程對(duì)環(huán)境污染也較小。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有乳制品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，該方法的建立可以為后期我國(guó)建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)參考，也可以為安全監(jiān)管部門(mén)提供技術(shù)支持。