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    分子印跡包裹的碳量子點(diǎn)熒光傳感器特異性吸附檢測(cè)核黃素

    2022-09-30 08:27:40劉爐英湯春琪吳家婷謝麗君
    分析科學(xué)學(xué)報(bào) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:核黃素超純水印跡

    劉爐英, 湯春琪, 吳家婷, 謝麗君

    (廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系,廣東廣州 510303)

    核黃素又稱維生素B2,為體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分,當(dāng)缺乏時(shí)會(huì)影響機(jī)體的生物氧化,造成代謝障礙,可產(chǎn)生口角炎、唇炎、舌炎、眼結(jié)膜炎和陰囊炎等癥狀[1,2]。目前核黃素的檢測(cè)方法有電化學(xué)檢測(cè)法[3,4]、酶聯(lián)免疫法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、比色檢測(cè)法[7]、高效液相色譜法[8,9]以及熒光檢測(cè)法[10,11]。

    碳量子點(diǎn)(CDs)具有優(yōu)異的水溶性、良好的光穩(wěn)定性和生物相容性等特性[12-15],但CDs作為熒光傳感器最大的挑戰(zhàn)是對(duì)目標(biāo)物的選擇性不高,在復(fù)雜的樣品中很難特異性識(shí)別目標(biāo)分子。因此為了提高CDs的選擇性、抗干擾性、靈敏度,在CDs表面包裹一層分子印跡層,大大提高熒光傳感器的特異性識(shí)別能力和熒光穩(wěn)定性,擴(kuò)大CDs在樣品前處理技術(shù)中的應(yīng)用范圍[16 - 18]。單發(fā)射特性的熒光傳感器會(huì)受到光漂白、背景干擾和儀器波動(dòng)等因素影響,其定量和定性能力受到一定的限制。因此使用比率熒光傳感器并引入雙發(fā)射波長(zhǎng),可以消除這些因素帶來(lái)的不利影響[13,19,20]。近年來(lái)分子印跡聚合物(MIPs)被廣泛用于與CDs結(jié)合以提高熒光傳感器的選擇性。本工作采用溶膠-凝膠原位聚合法,利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷為功能單體,正硅酸乙酯為交聯(lián)劑,形成分子印跡層包裹CDS,核黃素作為模板分子印跡在聚合物層形成嵌入式的CDS@MIPS材料,洗去模板分子后可對(duì)核黃素進(jìn)行特異吸附檢測(cè)。此方法將CDS固定在印跡層內(nèi),使得CDS與核黃素分子之間能量傳遞被印跡層分子阻隔難以發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,所以CDs的熒光信號(hào)不受核黃素的影響。因此,將碳量子點(diǎn)在460 nm波長(zhǎng)處的熒光作為參考信號(hào),目標(biāo)物核黃素在520 nm波長(zhǎng)處的熒光作為變量信號(hào),利用I520/I460的熒光比值隨著核黃素的濃度變化而變化,形成比率型熒光傳感器檢測(cè)食品中的核黃素。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    F97pro熒光光譜儀(中國(guó)上海,棱光技術(shù)有限公司);Tensor27紅外光譜分析儀(德國(guó),布魯克公司);MIRA3場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(捷克,泰思肯有限公司);JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本,電子株式會(huì)社)。

    無(wú)水檸檬酸、N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸乙酯(TEOS)、核黃素購(gòu)于阿拉丁試劑公司,其它試劑均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水均來(lái)自于超純水機(jī)純化的超純水(18.2 MΩ·cm)。

    1.2 CDs合成

    稱取0.5 g無(wú)水檸檬酸分散在10 mL AEAPMS中后,轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯里氮?dú)饷摎?0 min,然后將高壓釜在240 ℃下保持2 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,用圓筒過(guò)濾膜濾器(0.22 μm)過(guò)濾溶液,最后用石油醚洗滌濾液三次。將獲得的CDs分散在250 mL無(wú)水乙醇中,并在4 ℃下避光保存以供下一步使用。

    1.3 CDs@MIPs熒光傳感器的合成

    燒瓶中加入40 μL上述制備的CDs和100 mg核黃素,繼續(xù)加入350 μL APTES和1.5 mL TEOS,200 μL NH3·H2O和800 μL超純水組成的混合溶液,超聲分散20 min,在室溫下避光反應(yīng)24 h,通過(guò)離心收集產(chǎn)物[16]。用洗脫溶劑洗脫模板分子,直至用熒光分光光度計(jì)從洗脫溶劑中檢測(cè)不到模板分子。最后在60 ℃下真空干燥12 h,得到一種核黃素印跡的乳白色粉末CDs@MIPs。同時(shí),不加入核黃素采用相同的方法制備無(wú)印跡CDs@NIPs材料。

    1.4 CDs@MIPs檢測(cè)核黃素

    熒光測(cè)量條件:激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm,激發(fā)和發(fā)射縫寬度均為10 nm,激發(fā)電壓為750 V,分別記錄460 nm、520 nm處的熒光強(qiáng)度。將CDs@MIPs的粉末溶于超純水中,制作CDs@MIPs工作溶液(2.5 mg/mL、25 mg/mL)。核黃素的檢測(cè):1 mL CDs@MIPs上述儲(chǔ)備液與1 mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3~20 μmol/L)混合渦旋1 min后離心分離,用超純水沖洗3次后溶解至2 mL后檢測(cè)熒光。對(duì)照組CDs@NIPs的實(shí)驗(yàn)條件與CDs@MIPs的相同。

    2 結(jié)果與討論部分

    2.1 表征CDs@MIPs

    CDs@MIPs的形貌通過(guò)掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)表征如圖1A、1B所示,從圖中可以看出其呈現(xiàn)的是球形顆粒狀,直徑大致為50 nm,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CDs粒徑,說(shuō)明多個(gè)CDs是嵌在印跡層里,并非單核殼結(jié)構(gòu),且顆粒之間出現(xiàn)交聯(lián)。

    圖1 CDs@MIPs的表征:(A)掃描電鏡圖;(B)透射電鏡圖。Fig.1 Characterization of CDs@MIPs:(A) SEM;(B) TEM.

    FT-IR光譜如圖2A所示,比較CDs@MIPs洗脫前后與CDs@NIPs之間的差異,以及與核黃素進(jìn)行對(duì)比。從圖中可以看出為洗脫前CDs@MIPs存在核黃素2 375 cm-1特征峰,洗脫后的CDs@MIPs此峰消失,證明核黃素洗脫干凈。而CDs@MIPs洗脫前與后、CDs@NIPs三者都出現(xiàn)792 cm-1Si-O振動(dòng)峰,1 061 cm-1為Si-O-Si的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰,1 667 cm-1為仲酰胺羰基(C=O)的拉伸振動(dòng)峰,2 937 cm-1為C-H拉伸振動(dòng)峰,說(shuō)明成功合成CDs@MIPs。

    圖2B所示為CDs、CDs@MIPs、CDs@MIPs+核黃素、核黃素以及CDs@MIPs+核黃素的熒光發(fā)射光譜圖(右上圖分別對(duì)應(yīng)各個(gè)溶液的發(fā)光顏色)。從圖中可以看出CDs的熒光強(qiáng)度最大,發(fā)射峰位置在465 nm,并且右上角對(duì)應(yīng)的圖中發(fā)出明亮的藍(lán)光(a);CDs@MIPs的熒光強(qiáng)度相對(duì)于CDs減弱,可能由于分子印跡層阻擋部分熒光的發(fā)射,但發(fā)射峰依然在465 nm且發(fā)藍(lán)光(b)。CDs@MIPs+核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度相對(duì)CDs@MIPs有一定增強(qiáng)且發(fā)射峰在460 nm,溶液發(fā)綠光(c)。核黃素溶液發(fā)黃光,發(fā)射峰在520 nm處(d)。CDs@MIPs+核黃素(c)與CDs@MIPs+核黃素光譜理論加和(e)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩者幾乎重合,進(jìn)一步說(shuō)明CDs與核黃素之間的熒光相互不干擾,熒光傳感器的熒光光譜為CDs@MIPs和核黃素兩者的熒光峰疊加而成。因此此傳感器可利用CDs熒光作為參考信號(hào),核黃素?zé)晒庾鳛樽兞啃盘?hào)。CDs@MIPs在紫外光連續(xù)照射12 h后熒光強(qiáng)度幾乎不變,說(shuō)明合成的CDs@MIPs熒光穩(wěn)定。

    圖2 (A) CDs@NIPs(a)、CDs@MIPs(b)、CDs@MIPs +核黃素(c)和核黃素(d)的傅里葉紅外(FT-IF)光譜;(B)CDs(a)、25 mg/L CDs@MIPs(b)、25 mg/L CDs@MIPs+1.0 μmol/L 核黃素(c)、核黃素(d)、CDs@MIPs+核黃素理論加和熒光光譜圖(e)Fig.2 (A) FT-IR spectra of CDs@NIPs(a),CDs@MIPs(b),CDs@MIPs+riboflavin(c) and riboflavin(d);(B) Fluorescence spectra of CDs(a),CDs@MIPs(b),CDs@MIPs+ riboflavin(c),riboflavin(d) and theoretical adduct diagrams of CDs@MIPs+ riboflavin(e)

    2.2 優(yōu)化檢測(cè)條件

    實(shí)驗(yàn)選用甲醇-乙酸(90∶10,V/V)、甲醇-水(90∶10,V/V)、甲醇、超純水4種溶劑洗脫印跡層中的核黃素分子。CDs@MIPs使用每種洗脫劑洗脫10次、20次、30次、40次后真空干燥。如圖3A所示,CDs@MIPs經(jīng)過(guò)超純水洗脫30次之后比值最小且沒(méi)有變化,說(shuō)明印跡層中的核黃素被洗脫干凈,同時(shí)通過(guò)熒光檢測(cè)驗(yàn)證印跡層中的核黃素已經(jīng)被洗脫干凈。因此選擇超純水作為洗脫劑。

    優(yōu)化1.25 mg/L CDs@MIPs與核黃素萃取時(shí)間如圖3B所示,1.5 μmol/L核黃素與CDs@MIPs渦旋1 min時(shí)達(dá)到最大熒光比值,后續(xù)隨著渦旋時(shí)間的增加熒光比值降低??赡苡捎陔S著時(shí)間增加,吸附核黃素被重新溶解至溶液里,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中萃取時(shí)間選擇1 min。

    圖3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件:A)溶劑洗脫;B) 響應(yīng)時(shí)間 Fig.3 Optimization of experimental conditions:A) Solvent elution;B) Response time

    2.3 CDs@MIPs檢測(cè)核黃素

    選用CDs@MIPs兩個(gè)濃度分別為1.25 mg/L、12.5 mg/L,利用I520/I460與核黃素的濃度呈正比,對(duì)于低濃度CDs@MIPs檢測(cè)核黃素的濃度為0.15、0.25、0.40、0.50、1.0、1.5 μmol/L,線性方程為:Y=1.2661X+0.5984,R2=0.9948,利用3δ/k計(jì)算出檢出限為8.48 nmol/L。高濃度CDs@MIPs檢測(cè)核黃素的濃度為1.5、2.5、4.5、7.0 μmol/L,線性方程為:Y=0.05425X+0.7585,R2=0.9979,所以總的線性范圍為0.15~7.0 μmol/L。從圖4中可以看出,當(dāng)CDs@MIPs的濃度增加時(shí),I520/I460兩者的比值反而減小,可能由于當(dāng)升高CDs@MIPs的濃度時(shí),460 nm處的熒光增強(qiáng)。雖然在520 nm處的熒光也增強(qiáng)但是分母增大幅度更大使得比值減小。

    圖4 CDs@MIPs的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of CDs@MIPs

    選用CDs@NIPs兩個(gè)濃度分別為1.25 mg/L、12.5 mg/L,對(duì)于低濃度CDs@NIPs吸附核黃素的濃度為0.15、0.25、0.4、0.5、1.5 μmol/L進(jìn)行檢測(cè),得出線性方程為:Y=1.0990X+0.8664,R2=0.9573;而高濃度CDs@NIPs與核黃素濃度不呈線性關(guān)系。通過(guò)比較CDs@MIPs與CDs@NIPs兩者線性關(guān)系可知,CDs@NIPs吸附能力小于CDs@MIPs,說(shuō)明CDs@MIPs具有較好的特異性吸附能力。

    與其它已報(bào)道的方法進(jìn)行對(duì)比,此方法的線性范圍或檢出限比其它的方法具有優(yōu)勢(shì),如表1所示。

    表1 比較不同檢測(cè)核黃素的方法

    2.4 CDs@MIPs選擇性

    圖7 CDs@MIPs的選擇性Fig.7 The selectivity of CDs@MIPs

    將1 mL濃度2.5 mg/L CDs@MIPs溶液加入10 mL離心管中,然后加入1 mL 80 μmol/L的其它物質(zhì)。從圖5中可以看出CDs@MIPs、CDs@NIPs吸附核黃素的I520/I460熒光比值比吸附其它物質(zhì)高,因?yàn)楹它S素520 nm處有熒光信號(hào),使得熒光增強(qiáng)從而比值增強(qiáng),CDs@MIPs、CDs@NIPs吸附其它物質(zhì)的比值差不多。而且可以看出CDs@MIPs吸附核黃素的比值比CDs@NIPs的高,是因?yàn)镃Ds@MIPs利用空穴特異性吸附核黃素,使得核黃素濃度升高,說(shuō)明CDs@MIPs選擇性好。

    2.5 樣品測(cè)定

    選擇市面上常規(guī)的果汁,取10 mL果汁過(guò)濾稀釋至100 mL。將1 mL的CDs@MIPs溶液加入到10 mL離心管中,然后分別加入0.5 mL果汁和0.5 mL不同濃度的核黃素。如表1所示,原果汁中沒(méi)有檢測(cè)出核黃素含量。選擇分別加入0.3、0.7、2.0、6.0 μmol/L 4個(gè)濃度的核黃素于樣品中。從表中可以看出回收率范圍為82.2%~90.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.88%~1.15%。

    表2 果汁中核黃素的檢測(cè)

    3 總結(jié)

    本文成功制備核黃素印跡的CDs@MIPs材料,建立了對(duì)核黃素特異性吸附檢測(cè)的比率熒光傳感器,其線性范圍為0.15~7.0 μmol/L,檢出限為8.48 nmol/L。此熒光傳感器穩(wěn)定性好,靈敏度高,具有特異性,可以達(dá)到對(duì)樣品中核黃素特異性吸附檢測(cè)的效果,因此此傳感器有望在樣品前處理技術(shù)中得到進(jìn)一步應(yīng)用。

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