基于CdTe量子點(diǎn)熒光探針對CS2生物標(biāo)記物2-硫代噻唑烷-4-羧酸的快速檢測

何文濤， 包軍偉， 常瑞佰， 趙文浩， 王蓉蓉， 尚可霞

(河西學(xué)院，甘肅張掖 734000)

CS2是制造人造絲纖維、電子真空管、橡膠、四氯化碳和樹脂的原料[1,2]，而且是粘膠工業(yè)中不可替代的原料[3]。CS2本身具有揮發(fā)性，并可通過呼吸道吸入以及皮膚吸收，引起糖代謝紊亂和加速動脈粥樣硬化[4]。同時，長期密切接觸可導(dǎo)致以神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的全身性疾病[5,6]。2-硫代噻唑烷-4-羧酸(TTCA)是CS2在人體內(nèi)與谷胱甘肽反應(yīng)形成的一種雜環(huán)化合物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，接觸CS2幾乎完全局限于職業(yè)工作場所，CS2被人體吸入后大約有0.7%～2.3%在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為TTCA。因此，相關(guān)工作人員尿液中TTCA濃度可用于評估其接觸CS2的情況[8,9]。

現(xiàn)階段對尿液中TTCA的測定方法有氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11,12]、氣相色譜和質(zhì)譜法[7,13]。然而，這些技術(shù)存在儀器昂貴、維護(hù)成本高、時間冗長、選擇性低等缺點(diǎn)[1,6]。因此，開發(fā)一種簡便、可循環(huán)利用的具有高度敏感性和選擇性的方法，有利于保護(hù)人體健康。熒光傳感技術(shù)具有便攜性好、檢測限低、靈敏度高、操作簡便、響應(yīng)迅速等顯著優(yōu)點(diǎn)[14,15]。量子點(diǎn)(QDs)由于其獨(dú)特的發(fā)光特性，以及斯托克斯位移大、吸收光譜寬、抗光漂白強(qiáng)和熒光壽命長等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是一種很有前途的熒光探針[16,17]。本文采用一鍋法合成了巰基乙酸修飾的尺寸均一、水溶性較好的CdTe QDs，并基于TTCA在水環(huán)境中對該QDs的熒光猝滅作用的差異，建立了尿液中CS2的生物標(biāo)記物TTCA的分析新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

F98熒光分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)；Tecnai G2F20 JEM-2100F型透射電鏡(TEM)(美國，F(xiàn)EI公司)；Thermo Scientific Nicolet-is50型紅外光譜儀(美國)；RU-200B粉末X射線衍射儀(日本，Rigaku Corporation)；Solid Spec-3700/3700DUV型紫外可見分光光度計(UV/Vis)(日本，島津公司)；Sartorius 3-18KS高速冷凍離心機(jī)(德國)；納米粒度與Zeta電位分析儀(英國，Malvern)。

巰基乙酸(TGA，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；碲粉、NaBH4(上海中秦化學(xué)試劑有限公司)；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，北京索萊寶科技有限公司)；Cd(NO3)2·4H2O、NaOH(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)。實驗中所用試劑均為分析純，使用前未經(jīng)純化，所有溶液均采用二次蒸餾水配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 TGA修飾的CdTe QDs的合成CdTe QDs是在文獻(xiàn)方法[18]的基礎(chǔ)上稍加修改制備的。將1.44 mmol TGA與0.50 mmol Cd(NO3)2·4H2O置于三頸圓底燒瓶中，加二次蒸餾水200 mL溶解，將體系的pH值調(diào)節(jié)至11左右，并在攪拌下用氮?dú)夤呐?0 min進(jìn)行脫氣。將新制備的前驅(qū)體NaTeH(通過0.48 mmol Te粉末，2.10 mmol NaBH4和2 mL水在50 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)生成)加入到反應(yīng)體系中，繼續(xù)用氮?dú)夤呐?0 min。最后，在100 ℃下回流，并在不同時間取樣檢測CdTe QDs的熒光強(qiáng)度。將合成的CdTe QDs水溶液在室溫下冷卻后，4 ℃下儲存供后續(xù)使用。

CdTe QDs的純化：加入2倍體積的無水乙醇，在高速冷凍離心機(jī)上于10 000 r/min離心5 min，置于冷凍干燥儀得到CdTe QDs固體樣品。

1.2.2 實驗原理如圖1所示，基于TTCA在水環(huán)境中對該CdTe QDs熒光猝滅作用的差異，檢測尿液中CS2的生物標(biāo)記物TTCA。

圖1 CdTe QDs合成及作為熒光探針用于CS2生物標(biāo)志物(TTCA)檢測的示意圖Fig.1 Schematic diagram of synthesis of CdTe QDs and its use as a fluorescent probe for the detection of CS2 biomarker(TTCA)

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe QDs結(jié)構(gòu)表征

圖2(A)為所制備CdTe QDs的透射電鏡(TEM)圖片，右下插圖為粒徑分布圖。圖2(A)顯示，制備的CdTe QDs呈球形，其形貌大小均一，在水溶液中分散均勻，平均粒徑為4.3 nm。從圖2(B)HR-TEM圖像中可見，顆粒具有清晰的晶格條紋，圖中的晶格條紋間距約為0.24 nm，對應(yīng)于CdTe立方閃鋅礦結(jié)構(gòu)中的(111)晶面的晶格間距。從圖2(C)X射線衍射圖片所示，CdTe QDs的2θ值在24.07°、39.8°和46.97°處三個衍射峰分別對應(yīng)CdTe立方晶系的(111)、(220)和(311)3個晶面(JCDPS NO:15-0770)。

圖2 CdTe QDs的TEM(A)、HRTEM(B)和XRD圖(C)Fig.2 TEM image(A)，HRTEM image(B) and XRD pattern(C) of CdTe QDs

2.2 CdTe QDs光學(xué)性能

CdTe QDs的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜如圖3(A)、3(B)所示，隨著制備時回流時間的逐漸增加，CdTe QDs的吸收光譜和熒光光譜都出現(xiàn)了紅移，表明CdTe QDs已形成并隨著回流時間的延長納米晶粒逐漸長大。熒光強(qiáng)度先增后減，回流3.5 h，最大發(fā)射波長在560 nm左右時達(dá)到最大。如圖3(C)所示，CdTe QDs的熒光光譜的發(fā)射峰在558 nm處，且發(fā)射光譜窄而對稱，表明CdTe QDs具有高度的單分散性，粒徑大小均一。CdTe QDs具有較寬的激發(fā)區(qū)域，最佳激發(fā)波長在365 nm，因此選擇365 nm為熒光探針的最佳激發(fā)波長。

圖3 不同反應(yīng)時間CdTe QDs的熒光光譜(A)、紫外可見吸收光譜(B)和3.5 h CdTe QDs的激發(fā)和發(fā)射光譜(C)Fig.3 Fluorescence spectra(A) and UV-Vis absorption spectra(B) of CdTe QDs at different reaction times，and excitation and emission spectra(C) of 3.5 h CdTe QDs

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 緩沖溶液pH實驗使用Tris-HCl緩沖液(pH值在5～12之間)評估pH值對CdTe QDs光學(xué)性能的影響。如圖4(A)所示，隨著pH值升高，CdTe QDs的熒光強(qiáng)度先增后降，當(dāng)pH達(dá)到9時熒光強(qiáng)度最大。這是由于在酸性介質(zhì)中巰基以質(zhì)子化形式存在，減少了巰基與CdTe核心結(jié)構(gòu)之間的相互作用[19]。因此，當(dāng)pH值小于5時納米顆粒變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致聚集致使發(fā)光強(qiáng)度降低或完全抑制；而在高堿性介質(zhì)(pH>9)中時，核心結(jié)構(gòu)中的鎘可能形成了不溶性氫氧化物，從而從材料中釋放導(dǎo)致納米顆粒離解和弱發(fā)光[20]。此外，在pH為9時TGA修飾的CdTe QDs表面羧基被去質(zhì)子化，通過靜電排斥避免聚集，確保納米粒子良好的分散性和穩(wěn)定性。因此，選擇pH為9.0進(jìn)行實驗。

2.3.2 TTCA與CdTe QDs的反應(yīng)時間實驗記錄了添加分析物TTCA后1～9 min內(nèi)不同時間間隔的探針熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖4(B)。在添加分析物后，探針熒光強(qiáng)度F與空白F0的比值在1 min后幾乎是恒定的。在TTCA存在下，探針的快速響應(yīng)是現(xiàn)場監(jiān)測中一個突出的優(yōu)勢。因此，選擇在3 min后記錄探針的熒光光譜。

圖4 (A) 不同pH值對CdTe QDs 熒光強(qiáng)度的影響；(B) 反應(yīng)時間對體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 (A) Effects of different pH values on the fluorescence intensity of CdTe QDs;(B) Effect of reaction time on fluorescence intensity of system

2.4 CdTe QDs熒光探針對TTCA的特異性

TTCA作為CS2的生物標(biāo)志物，通常在尿液中檢測。為了評價CdTe QDs熒光探針對檢測TTCA的特異性，在相同條件下，用不同尿液成分如尿素(Urea)、葡萄糖(Glu)、尿酸(UA)、肌酸(Creatine)、KCl、肌酐(Creatinine)、NaCl、Na2SO4和NH4Cl對熒光探針體系進(jìn)行實驗。如圖5(A)、5(B)所示，在2.00 mL的CdTe QDs溶液中，分別加入4 μmol的其他尿液成分，將探針發(fā)射光譜與加入相同體積水的探針發(fā)射光譜相比，并無明顯的變化。然而，加入相同量TTCA時的發(fā)射光譜卻完全猝滅，并且在紫外燈照射下，肉眼可以很容易區(qū)分加TTCA和其他尿液中化學(xué)物質(zhì)對CdTe熒光探針發(fā)射強(qiáng)度的影響，見圖5(C)，只有TTCA可以誘導(dǎo)探針發(fā)射的綠色熒光消失。這表明CdTe QDs可以作為一種熒光探針用于水環(huán)境中TTCA的檢測。

圖5 CdTe QDs中加入尿液不同成分時的發(fā)射光譜圖(A)、熒光強(qiáng)度變化圖(B)和365 nm紫外光下含尿液不同成分CdTe QDs的照片(C)Fig.5 Emission spectra(A)，fluorescence intensity changes(B) when different components of urine are added to CdTe QDs,and photos of CdTe QDs containing different components of urine under 365 nm ultraviolet light(C)

2.5 抗干擾實驗

如圖6所示，在2.00 mL的CdTe QDs探針溶液中分別加入4.0 μmol的其他尿液成分后，體系的熒光強(qiáng)度并沒有發(fā)生明顯的變化。而通過進(jìn)一步添加4.0 μmol的TTCA探針的熒光基本消失，其結(jié)果與僅添加TTCA時的結(jié)果相似。這說明TTCA對CdTe QDs探針在水介質(zhì)中的猝滅作用不受共存組分的影響，CdTe QDs熒光探針在尿液檢測TTCA的過程中具有良好的抗干擾能力。

圖6 在背景濃度為4.0 μmol的不同的尿液化學(xué)組分溶液中，加入TTCA(4.0 μmol)前后CdTe量子點(diǎn)的發(fā)射強(qiáng)度(λex=365 nm)Fig.6 Emission intensities of the CdTe QDs(λex=365 nm)upon the addition of TTCA(4.0 μmol) in the presence of a background concentration of various urine chemicals(4.0 μmol) in aqueous solution

2.6 CdTe QDs探針對TTCA的分析性能

為了進(jìn)一步探索CdTe QDs探針檢測痕量TTCA的能力，通過向2.00 mL的CdTe QDs探針中逐步滴加TTCA進(jìn)行了熒光滴定實驗，并監(jiān)測在558 nm處的發(fā)射強(qiáng)度。從圖7(A)所示，隨著TTCA濃度從0增加到2.0 mmol/L，熒光探針熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低；當(dāng)TTCA濃度達(dá)到1.3 mmol/L時，熒光猝滅效率(QE)達(dá)到50.16%。(QE=(F0-F)/F0×100%)[1]。式中F0和F分別是添加TTCA前后CdTe熒光探針的發(fā)光強(qiáng)度。當(dāng)TTCA濃度高于2.0 mmol/L時，幾乎沒有檢測到明顯的發(fā)射，QE值超過了98%。

如圖7(B)所示，TTCA濃度在0.04975～1.5254 mmol/L范圍內(nèi)與體系的相對熒光強(qiáng)度變化值((F0-F)/F0)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.3365x+0.06494，相關(guān)系數(shù)R2=0.9980。通過公式3σ/s(其中，s為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，σ為11次空白測試得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差)，得出TTCA的檢出限為0.045 mmol/L。

圖7 (A)CdTe QDs在不同濃度TT CA水溶液中的熒光光譜；(B)CdTe QDs體系的發(fā)射強(qiáng)度與TTCA濃度呈線性關(guān)系(插圖：低濃度范圍內(nèi)CdTe QDs體系的發(fā)射強(qiáng)度與TTCA濃度關(guān)系)Fig.7 (A) Emission spectra of CdTe QDs dispersed in aqueous solutions with different concentrations of TTCA；(B) The linear relationship between the emission intensity of CdTe QDs and the concentrations of TTCA(Inset:the relationship between emission intensity of CdTe QDs system and the concentration of TTCA in low concentration range)

2.7 熒光猝滅法定量分析TTCA的含量

為評估該方法的實用性，通過向健康志愿者尿樣中分別加入確定量的TTCA得到待分析試樣，采用本熒光體系進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表1所示。測量含有3種不同濃度的TTCA尿液時，測定的回收率在96.9%～122.8%范圍內(nèi)。結(jié)果表明，該CdTe QDs熒光探針體系對人體尿液中TTCA檢測有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 尿液中TTCA含量分析(n=3)

2.8 CdTe探針對TTCA的可能響應(yīng)機(jī)理

量子點(diǎn)熒光探針的猝滅機(jī)理一般包括能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)、內(nèi)濾作用(IFE)或非輻射復(fù)合。如圖8(A)所示，水溶液中CdTe QDs熒光探針的發(fā)射光譜和TTCA吸收光譜之間沒有重疊，因此可以排除FRET導(dǎo)致的熒光猝滅機(jī)制。在水中尿液成分紫外-可見光譜測定結(jié)果顯示，雖然TTCA和尿酸、肌酸、肌酸酐在200 nm至360 nm范圍內(nèi)顯示出強(qiáng)烈的吸收，并且與CdTe QDs的吸收帶重疊，但只有TTCA造成探針熒光猝滅(圖5A)。此外，在365 nm的激發(fā)波長下，TTCA和其他9種尿液成分都沒有明顯的吸收。因此排除了TTCA因IFE導(dǎo)致的熒光猝滅的可能性。

如圖8(B)所示，與CdTe QDs和TTCA紫外-可見吸收光譜的數(shù)學(xué)疊加相比，CdTe QDs在加入TTCA之后，混合物的吸收光譜發(fā)生了變化，在320 nm附近紫外吸收增加。此外，TTCA滴定也導(dǎo)致 CdTe QDs熒光光譜出現(xiàn)紅移(圖7A)，這意味著CdTe QDs和TTCA之間形成了非熒光配合物[20,21]，表明TTCA對CdTe探針的熒光猝滅是一個靜態(tài)過程，探針與TTCA之間通過靜電相互作用形成配合物。

圖8 (A)肌酸、肌酸酐、尿酸、TTCA、CdTe QDs的紫外-可見吸收光譜和CdTe QDs的熒光發(fā)射光譜；(B)CdTe QDs、TTCA和加入TTCA后CdTe的紫外-可見吸收光譜Fig.8 (A) UV-Vis spectra of creatine,creatinine,UA,TTCA,CdTe QDs and fluorescence emission spectrum of CdTe QDs;(B) UV-Vis spectra of CdTe QDs,TTCA and CdTe with addition of TTCA

3 結(jié)論

本文制備了具有良好穩(wěn)定性和發(fā)光性能的水溶性CdTe QDs，并基于CS2的生物標(biāo)志物TTCA對CdTe QDs熒光探針的靜態(tài)猝滅作用，建立了快速檢測TTCA的熒光新分析方法。在CS2的生物標(biāo)志物TTCA的快速檢測方面具有應(yīng)用潛力，有望成為接觸CS2職業(yè)人群的班末尿中TTCA的快速檢測的方法。