白粉病菌對結果期南瓜葉片光合特性和葉綠體超微結構的影響

葉佳凈，趙錦鵬，卞世杰，郭衛(wèi)麗，李新崢

（河南科技學院 園藝園林學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

南瓜屬主要栽培種中國南瓜（CucurbitamoschataDuchesne，俗稱倭瓜、番瓜）、印度南瓜（Cucurbita maximaDuchesne，俗稱筍瓜）和美洲南瓜（Cucurbita pepoL.俗稱西葫蘆），在世界范圍廣泛栽培，具有重要的經濟價值[1]。白粉病是普遍發(fā)生且嚴重危害南瓜生產的一種真菌性病害，其發(fā)病率高、發(fā)病面積大、傳播速度快，在黑龍江、河南、甘肅以及陜西關中等地區(qū)發(fā)生日趨嚴重，成為限制南瓜生產的重要因素[2-4]。南瓜白粉病主要侵染葉片，發(fā)病初期葉面出現(xiàn)白色小斑點，隨后擴散至整個葉片，表現(xiàn)為覆蓋白色粉狀物；發(fā)病后期白粉病斑由白色變?yōu)辄S褐色，有分生孢子閉囊殼產生，葉片發(fā)黃嚴重甚至焦枯，嚴重影響植株正常光合作用，降低南瓜的產量與品質[5]。

病原菌侵染時，植物光合效率降低，通常與光合器官受損、光合代謝所需激發(fā)能過量增加有關，最終導致氧氣的下降和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生[6-8]。過量ROS積累間接誘導植物的過敏性反應（Hypersensitive reaction，HR）[9]。HR是植物與病原菌不親和互作發(fā)生的一種抗病反應，表現(xiàn)為在病原菌侵染處形成不同于周圍健康組織的局部細胞壞死斑[10]，是細胞程序性死亡的主要形式，可以激發(fā)鄰近組織的防衛(wèi)反應和植株的系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）[11]。甜瓜幼苗感染白粉病后光合指標下降，包括凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）[12]。張兆輝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，接種白粉病菌的西葫蘆葉片葉綠體結構發(fā)生類囊體膨大、基質片層和基粒片層扭曲等變化。白粉病降低植物的光合作用，但關于白粉病菌如何影響南瓜光合特性的機制報道很少。鑒于南瓜果實發(fā)育期開花和幼果生長階段易暴發(fā)白粉病，以白粉病不同抗性南瓜品種為試材，研究白粉病菌對南瓜結果期葉片光合指標、細胞壞死及葉綠體超微結構的影響，分析其光合特性變化的生理機制，以期豐富南瓜抗白粉病的機制研究理論。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試南瓜材料為中國南瓜品種九江轎頂（JJJD）和自交系112-2，其中JJJD 高感白粉病，112-2 高抗白粉病。2001 年至今，在實驗室人工接種白粉病菌，自交系112-2 幼苗期植株均表現(xiàn)出穩(wěn)定的高抗白粉病特性[14-15]。在田間自然發(fā)病條件下，南瓜結果期自交系112-2 整株基本未出現(xiàn)白粉癥狀，而相鄰定植的JJJD 中下部葉片布滿大小不一的白粉斑，發(fā)病嚴重的基部葉片出現(xiàn)萎黃、早衰癥狀，并向上蔓延。112-2和JJJD 種子均由河南科技學院南瓜課題組提供。

1.2 試驗設計

2020 年4 月在河南科技學院育種實驗室將供試南瓜種子浸種催芽后播種于穴盤內，幼苗長至兩葉一心時移栽到口徑為30 cm 的大盆中，將大盆搬至室外進行盆栽管理，植株進入結果期即第1 朵雌花開花后，進行白粉病菌接菌處理。采集感白粉病的南瓜葉片[白粉病菌為單囊殼屬白粉菌（Podosphaera xanthii）]，用軟毛刷將白粉病菌孢子掃入培養(yǎng)皿內，無菌水稀釋，調整孢子懸浮液終濃度為1×105個/mL。采用噴霧法將白粉病菌孢子懸浮液噴灑于結果期南瓜第1 朵雌花上下的2 片葉片，以葉片布滿霧滴狀水珠但不滴落為宜，CK 噴清水（不接種白粉病菌）。以112-2-PM、JJJD-PM 分別表示112-2、JJJD 接種白粉病菌處理，112-2-CK、JJJD-CK分別表示112-2、JJJD清水對照處理。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 光合參數測定 自然光照條件下，隨機選取清水（CK）和白粉病菌處理的結果期南瓜植株各9株，每株選擇雌花附近、長勢一致的2 片葉片做標記，于9:00—11:00 間用Li-6400 便攜式光合儀測定南瓜葉片的Pn、Gs、Tr和Ci，從接種白粉病菌當天開始，間隔1 d 測1 次，至接種后第12 天結束，即0、2、4、6、8、10、12 d。每個葉片重復測定3次。

1.3.2 壞死斑觀察 分別在接種白粉病菌后0、4、5、6 d 隨機選取2 種南瓜材料各12 株，每株選擇雌花附近、長勢一致的葉片，避開葉脈，剪取葉片樣本大小1 cm×1 cm，設置3個重復。將剪取的南瓜葉片浸沒在臺盼藍染色液中，沸水浴2 min 后，乙醇脫色至透明。將脫色后的葉片制成玻片，在倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞壞死斑被臺盼藍染色劑染成藍色。每個樣品取10個視野。

1.3.3 葉綠素含量測定 參照蔡慶生[16]的方法。分別于接種白粉病菌后0、4、8、12 d隨機選取2種結果期南瓜植株各12 株，每株選擇雌花附近、長勢一致的葉片，避開葉脈剪碎混勻，稱取0.2 g放于研缽中，倒入95%乙醇及少量碳酸鈣，研磨成勻漿，靜置3～5 min 后過濾，95%乙醇定容至25 mL，搖勻，設置3次重復。測定葉綠素a（Ca）含量、葉綠素b（Cb）含量以及總葉綠素（CT）含量。

Ca（mg/g）=13.95A665-6.88A649，

Cb（mg/g）=24.96A649-7.32A665，

CT（mg/g）=6.63A665+18.08A649。

1.3.4 葉綠體超微結構觀察 接種白粉病菌后4 d，選取112-2 和JJJD 南瓜各3 株，取上述相同葉位的葉片，以健康無病害的葉片作CK。用鋒利徠卡刀片避開主葉脈切取0.5 mm×1.0 mm 的小塊，快速投入裝有預冷戊二醛（4%）溶液的青霉素小瓶中，用注射器抽氣至材料大部分下沉于瓶底部，4 ℃下固定6 h；用磷酸緩沖液（0.1 mol/L）沖洗3 次，每次30 min；四氧化餓固定液二次固定6 h，磷酸緩沖液再次沖洗；用不同體積分數的（15%、30%、50%、70%、80%、90%、100%）乙醇連續(xù)脫水2 次，每次30 min；丙酮過渡，環(huán)氧樹脂滲透包埋，在35 ℃12 h、45 ℃12 h、60 ℃24 h 條件下分別聚合；用LEICA EM UC7 型超薄切片機鉆石刀切片，切片厚60～80 nm，25 ℃下用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛進行雙重染色。于HITACHI-HT7700 型透射電子顯微鏡下觀察拍照，每個樣品取10個視野。

1.4 數據處理與分析

所有數據均取3 次重復的平均值，數據分析和作圖分別用SPSS 2.0軟件和Excel 2003進行。

2 結果與分析

2.1 白粉病菌對南瓜結果期葉片光合指標的影響

圖1 顯示，接種白粉病菌后，2 種材料（112-2 和JJJD）葉片的Pn、Tr 和Gs 均低于清水對照，JJJD 的Pn 下降幅度總體上大于112-2，其中，112-2 和JJJD葉片Pn 在接種后2 d 分別比相應對照降低45.4%和63.8%；但接種后6～10 d，2 種材料葉片的Ci 則高于對照?？剐圆牧?12-2 接菌后總體上表現(xiàn)為Pn 高于感病材料JJJD 接菌處理，Ci低于感病材料JJJD 接菌處理?？梢?，白粉病會影響結果期南瓜葉片的光合效率，降低Pn、Tr 和Gs，增加Ci，說明白粉病菌侵染降低了葉片對Ci 的利用率，此外，感病材料中這種影響高于抗病材料。

圖1 白粉病菌對南瓜材料112-2和JJJD結果期葉片光合指標的影響Fig.1 Effect of powdery mildew pathogens on photosynthetic indexes of leaves of pumpkin（112-2 and JJJD）at fruiting stage

2.2 白粉病菌對南瓜結果期葉片葉綠素含量的影響

圖2顯示，與CK 相比，接種白粉病菌后，JJJD 的Ca、Cb 和CT 含量在接菌前期（接種后0～8 d）無明顯變化，而在接種后第12天明顯降低，與CK相比分別降低50.0%、47.0%和49.0%；材料112-2 Ca、Cb 和CT含量在接種后4 d和12 d明顯低于CK，其中接種后12 d 分別下降65.0%、54.0%和57.0%，降幅明顯高于感病材料JJJD。表明白粉病菌侵染降低了南瓜結果期葉片Ca、Cb 和CT 的含量，其中Ca 含量下降最多，且抗病材料葉綠素含量的下降幅度較大。

圖2 白粉病菌對南瓜材料112-2和JJJD結果期葉片葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of powdery mildew pathogens on chlorophyll content in leaves of pumpkin（112-2 and JJJD）at fruiting stage

2.3 白粉病菌對南瓜結果期葉片細胞壞死的影響

圖3 顯示，接種白粉病菌后4 d，112-2 和JJJD均出現(xiàn)壞死斑，隨著接種后時間的延長，壞死斑面積增大、顏色加深，感病材料JJJD 壞死斑面積明顯大于抗病材料112-2 且顏色較深，表明接種白粉病菌誘發(fā)結果期南瓜葉片出現(xiàn)HR，感病材料HR 發(fā)生較嚴重。

圖3 結果期南瓜接種白粉病菌后葉片細胞壞死的觀察Fig.3 Observation of cell necrosis in powdery mildew-infected pumpkin leaves at fruiting stage

2.4 白粉病菌對南瓜結果期葉片葉綠體超微結構的影響

圖4 顯示，清水處理南瓜材料（112-2 和JJJD）葉綠體呈現(xiàn)長橢圓形，緊靠細胞膜分布，葉綠體膜結構清晰平滑，基質片層和基粒片層排列緊密，片層垛疊整齊均勻，有少量電子密度高的嗜鋨體存在。接種白粉病菌后4 d，112-2 葉片葉綠體大多腫脹變形，并向細胞中央游離，基質片層排列疏松，基粒片層不規(guī)則排列，嗜鋨體增多，積累較多的淀粉粒；JJJD 葉片葉綠體的腫脹程度大于112-2，葉綠體間擠壓嚴重，細胞膜、基質片層、基粒片層模糊不清，淀粉粒較多，并形成大量油滴。

圖4 結果期南瓜接種白粉病菌后葉綠體超微結構的觀察Fig.4 Chloroplast ultrastructure observasion of powdery mildew-infected pumpkin leaves at fruiting stage

3 結論與討論

植物葉片光合系統(tǒng)對白粉病非常敏感。金海軍等[17]研究表明，在感染白粉病菌的17 份黃瓜材料中大多數材料Pn、Tr、Gs明顯降低，Ci增加。本研究也表明，結果期接種白粉病菌的南瓜葉片Pn、Tr、Gs均降低，而Ci 增加。通常，氣孔關閉和葉肉細胞光合活性下降導致的非氣孔因素是病原菌脅迫引起植物光合作用下降的主要影響因素。FARQUHAR等[18]研究表明，Gs 下降，Ci 不變或上升，光合速率下降是由葉肉細胞同化能力降低等非氣孔因素引起的。本試驗結果顯示，結果期接種白粉病菌后，南瓜葉片的Gs 下降，Ci 上升，說明非氣孔因素是南瓜葉片光合作用降低的主要原因之一，這與李寧等[19]和王瑩等[20]的研究結果一致。

植物的光合作用受過敏反應抑制，光合作用受抑制又會導致ROS 產生[21]，ROS 影響葉綠體PSⅡ的活性，被侵染的細胞由于PSⅡ活性喪失，干擾了細胞存活所必需的動態(tài)平衡，反過來加速了過敏反應[22]。本試驗中，接種白粉病菌后4 d，南瓜（112-2和JJJD）葉片均出現(xiàn)明顯的過敏反應，隨著接種后時間的延長，感病材料JJJD 細胞壞死斑面積擴展更大，進一步限制了葉片的光合速率，說明過敏反應與南瓜材料的抗/感病性有關，在抗性材料112-2 上白粉病菌的生長受到有效抑制[13]。

病原菌侵染植物后可破壞葉綠體的結構和功能，使葉綠素含量下降。甜瓜感染白粉病后葉綠素含量下降[23]。本試驗發(fā)現(xiàn)，接種白粉病菌后，南瓜材料Ca、Cb 和CT 含量均明顯下降，且抗性材料112-2葉綠素含量的下降幅度較大，與柯思佳等[24]研究認為抗性甜瓜材料能減緩蔓枯病對葉綠素含量的影響不同，這可能與試驗品種或測定時間不同有關。葉綠體是植物光合反應的主要場所，其結構的穩(wěn)定與否直接影響光合作用的強弱[25]，甘薯感染瘡痂病后葉綠素被降解，葉綠體超微結構發(fā)生變化，葉綠體膜流動性降低，感病品種葉綠體受損程度遠大于抗病品種[26]。本試驗發(fā)現(xiàn)，南瓜感染白粉病菌后葉綠體腫脹變形，基質片層排列疏松，基粒片層不規(guī)則排列，嗜鋨體和淀粉粒增多，且感病材料葉綠體結構受損更為嚴重。病原菌侵染導致植株產生大量ROS，引起葉綠體膜過氧化[27]，造成葉綠素降解，致使植物光合能力下降。ROS 對膜系統(tǒng)的損傷進一步阻礙了淀粉的水解和向外運輸，導致葉綠體中大量淀粉粒累積，淀粉的這種積累稱為被動存儲[28]。大量淀粉顆粒的產生擠壓葉綠體，使葉綠體腫脹加劇，南瓜接種白粉病菌后葉綠體中嗜鋨體數量增多反映葉綠體膜受到了過氧化損傷，感病材料JJJD 葉綠體中出現(xiàn)大量油滴表明葉綠體膜過氧化程度加深，對葉綠體結構造成了不可逆的損傷?？傊?，結果期白粉病菌侵染引起南瓜葉片光合性能下降，主要歸因于侵染點細胞壞死、葉綠素含量下降和葉綠體結構受到破壞，抗病材料112-2 光合速率降幅較小與細胞壞死和葉綠體結構受損程度較輕有關。