非洲豬瘟病毒MGF360-14L靶向MAVS抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生

王 洋，崔 帥，鑫 婷，王西西，于海男，陳世鈺，蔣亞君， 高新桃，龐忠寶，姜一曈，郭曉宇，賈 紅，朱鴻飛*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,北京 100080； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病。ASFV是一種核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒，基因組全長(zhǎng)170～193 kb，編碼150～167個(gè)開放閱讀框。自2018年傳入我國(guó)以來(lái)，非洲豬瘟疫情在全國(guó)范圍內(nèi)迅速擴(kuò)散，給中國(guó)以及全球造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國(guó)出現(xiàn)了基因I型ASFV，臨床表現(xiàn)為亞急性型或慢性型，嚴(yán)重增加了ASF防控難度。ASFV編碼多種蛋白質(zhì)，通過(guò)干擾宿主的天然免疫系統(tǒng)，抑制和逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為自身的增殖、擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件。例如，MGF505-7R抑制p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)移，與STING、TBK1和IKKα互作，抑制cGAS-STING通路介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；MGF505-11R能夠與STING互作，通過(guò)泛素化途徑降解STING，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；E120R能夠與IRF3互作，抑制TBK1對(duì)IRF3的招募和IRF3的磷酸化，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)是抗RNA病毒信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白。在病毒入侵機(jī)體時(shí)，RIG-I樣受體(RIG-I-like receptor, RLR)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，RIG-I與MAVS相互作用激活MAVS，進(jìn)而活化下游NF-κB和IRF3的信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)。然而，在病毒進(jìn)化過(guò)程中也具備了拮抗MAVS的策略，以此逃避先天性免疫系統(tǒng)。例如，日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)NS1蛋白通過(guò)抑制MAVS的表達(dá)，抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1蛋白與MAVS結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制MAVS與TRAF3的結(jié)合，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；登革熱病毒(dengue virus, DENV)NS4A蛋白與MAVS互作，抑制MAVS與RIG-I的結(jié)合，從而抑制IRF3的活化。

在研究ASFV多基因家族(multigene families，MGF)成員MGF360-14L對(duì)Ⅰ型干擾素通路影響的過(guò)程中，作者發(fā)現(xiàn)MGF360-14L能夠與MAVS相互作用，并且能夠抑制MAVS介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，從而逃避宿主先天性免疫反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胚腎細(xì)胞HEK293T和豬腎細(xì)胞PK-15采用含有10%胎牛血清、1%雙抗DMEM培養(yǎng)基在5% CO和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒 合成ASFV-18毒株360-14L全長(zhǎng)基因(GenBank No.MH 766894)，然后亞克隆入p3×Flag-CMV-7.1質(zhì)粒和pCMV-N-eGFP質(zhì)粒；21和全長(zhǎng)基因從PK-15細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增，然后分別亞克隆入pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-HA載體；cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β-luc和pRL-TK等表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 兔抗TBK1/NAK、P-TBK1、IRF3、P-IRF3、GAPDH、eGFP-Tag、HA-Tag抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體以及鼠抗Myc和Flag標(biāo)簽抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；轉(zhuǎn)染試劑(JetPRIME Kit)購(gòu)自Polyplus Transfection公司。雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；免疫共沉淀試劑盒(Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit)購(gòu)自Thermo公司；羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor488)和羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor594)熒光二抗購(gòu)自Abcam公司；RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptRT Master Mix)購(gòu)自寶生物(TaKaRa)公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 收集細(xì)胞提取總RNA，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟參見RNA提取試劑盒(TaKaRa)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)。使用SYBR熒光染料和ABI7900HT熒光定量PCR儀進(jìn)行樣品的檢測(cè)。PCR體系：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s和72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。RT-qPCR的引物序列:pig-GAPDH-F：5′-CGTCCCTGAGACACGATGGT-3′，pig-GAPDH-R：5′-GGAACATGTAGACCATGTAG-3′；pig-IFN-β-F：5′-GTGGAACTTGATGGGCAGAT-3′，pig-IFN-β-R：5′-TTCCTCCTCCATGATTTCCTC-3′。

1.2.2 雙熒光素酶檢測(cè) 首先將HEK293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)，然后鋪48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。將IFN-β-luc和pRL-TK與cGAS、STNG、TBK1、MGF360-14L、TRIM21、MAVS或空載共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，具體操作步驟參見雙熒光素酶說(shuō)明書(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2.3 免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-IP) HEK293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右，依據(jù)具體試驗(yàn)轉(zhuǎn)染p3×Flag-MGF360-14L、p-CMV-eGFP-MGF360-14L、pcDNA3.1-Myc-TRIM21、pcDNA3.1-HA-MAVS、p3×Flag-MAVS、pCDEF-HA-Ub或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染后24 h，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3次，然后用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的IP裂解液裂解細(xì)胞，在4 ℃條件下，12 000×離心10 min，取上清，4 ℃保存?zhèn)溆?。將磁珠與標(biāo)簽抗體Flag或HA在旋轉(zhuǎn)器上室溫孵育1 h，然后清洗結(jié)合了抗體的磁珠，再將制備好的細(xì)胞上清與磁珠4 ℃過(guò)夜孵育，清洗磁珠后用洗脫液洗脫，洗脫下來(lái)的樣品加入loading buffer 100 ℃煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) HEK293T細(xì)胞鋪于激光共聚焦培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右，轉(zhuǎn)染p3×Flag-MGF360-14L和pcDNA3.1-HA-MAVS質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，然后0.1% Triton X-100透膜15 min，5%的BSA封閉1 h，一抗分別采用鼠抗Flag和兔抗HA標(biāo)簽抗體4 ℃過(guò)夜孵育，二抗分別采用羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor488)和羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor594)抗體37 ℃孵育1 h，最后用DAPI著染細(xì)胞核，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot分析 轉(zhuǎn)染了相應(yīng)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞被含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解后，在4 ℃ 12 000×離心10 min，收集裂解液上清。采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)對(duì)收集的裂解液進(jìn)行蛋白定量。裂解液加入SDS-PAGE loading buffer后100 ℃煮沸10 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂乳封閉后，分別用對(duì)應(yīng)蛋白或標(biāo)簽的抗體孵育，然后進(jìn)行二抗孵育，最后進(jìn)行ECL顯色。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 本研究中的試驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)，使用GraphPad Prism 8軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析分析方法采用Student’s-test(.<0.05；.<0.01；.<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV MGF360-14L抑制MAVS介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素通路

已有研究表明，ASFV MGF的一些成員能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。為了確定MGF360-14L對(duì)Ⅰ型干擾素的影響，將MGF360-14L-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并用5 μg·mL的poly(I:C)誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MGF360-14L能夠明顯抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的-β mRNA的產(chǎn)生(圖1A)，熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示MGF360-14L能夠抑制MAVS誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性(圖1B)。

A.HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染MGF360-14L-Flag蛋白表達(dá)質(zhì)粒和poly(I:C)后24 h收集細(xì)胞，用RT-qPCR檢測(cè)IFN-β mRNA；B. 雙熒光素酶檢測(cè)MAVS誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，并進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的Western blot檢測(cè)A. HEK293T cells were co-transfected with the MGF360-14L-expressing plasmid and poly(I:C) for 24 h and then harvested for RT-qPCR assay to determine IFN-β mRNA levels; B. Double luciferase was used to detect IFN-β promoter activity induced by MAVS, expression of MAVS-HA and MGF360-14L-Flag was analyzed by Western blot圖1 ASFV MGF360-14L蛋白基因?qū)AVS信號(hào)通路的抑制Fig.1 MGF360-14L inhibited IFN-β mRNA production and IFN-β promoter activity

2.2 MGF360-14L與MAVS互作

由于MGF360-14L能夠抑制MAVS介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，為確定其具體作機(jī)制，作者將MGF360-14L-Flag和MAVS-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)，結(jié)果表明，MGF360-14L能夠與MAVS結(jié)合(圖2A)，反過(guò)來(lái)MAVS同樣能夠與MGF360-14L結(jié)合(圖2B)。并且共定位試驗(yàn)表明，MGF360-14和MAVS存在胞質(zhì)內(nèi)共定位(圖2C)。

A、B. MGF360-14L-Flag和MAVS-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)；C.將MGF360-14L-Flag和MAVS-HA共轉(zhuǎn)染鋪有HEK293T細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗(yàn)，標(biāo)尺為25 μmA, B. HEK293T cells were co-transfected with MGF360-14L-Flag and MAVS-HA plasmids, the cells were collected 24 h after transfection for Co-IP assay; C. HEK293T cells were transfected with MGF360-14L-Flag and MAVS-HA plasmids for laser confocal test. The scale is 25 μm圖2 ASFV MGF360-14L蛋白與MAVS互作Fig.2 MGF360-14L interacts with MAVS

2.3 MGF360-14L抑制TRIM21和MAVS誘導(dǎo)的IRF3磷酸化及IFN的產(chǎn)生

三重基序蛋白21(tripartite motif protein 21, TRIM21)能夠促進(jìn)線粒體抗病毒信號(hào)蛋白(MAVS)的K27多聚泛素化從而增強(qiáng)TBK1的招募和活化IRF3，從而啟動(dòng)Ⅰ型干擾素的表達(dá)。為了確定MGF360-14L是否能夠抑制TRIM21和MAVS引起的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，作者將不同濃度的MGF360-14L、TRIM21、MAVS以及啟動(dòng)子報(bào)告基因IFN-β-luc和內(nèi)參報(bào)告基因pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)。結(jié)果顯示，MGF360-14L能夠抑制TRIM21和MAVS共同誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，且呈劑量依賴性(圖3A)。已有研究表明，TRIM21通過(guò)與MAVS作用，促進(jìn)IRF3的磷酸化，促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。作者將MGF360-14L-Flag、TRIM21-Myc和MAVS-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，MGF360-14L對(duì)MAVS和TRIM21誘導(dǎo)的TBK1和IRF3磷酸化具有抑制作用(圖3B)。

A. 雙熒光素酶檢測(cè)不同濃度的ASFV MGF360-14L蛋白對(duì)MAVS/TRIM21誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性的抑制作用；B. Western blot 檢測(cè)MGF360-14L蛋白對(duì)MAVS誘導(dǎo)的TBK和IRF3的抑制作用A. Dual luciferase assay was used to detect the inhibitory effect of different concentrations of ASFV MGF360-14L on MAVS/ TRIM21-induced IFN-β promoter activity; B. TRIM21-Myc,TBK1, P-TBK1, IRF3, P-IRF3, MAVS-HA and MGF360-14L-Flag were analyzed by Western blot圖3 ASFV MGF360-14L抑制MAVS誘導(dǎo)的TBK1和IRF3的磷酸化Fig.3 MGF360-14L inhibits the phosphorylation of TBK1 and IRF3

2.4 MGF360-14L競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MAVS

前期研究結(jié)果表明，MGF360-14L和TRIM21互作，并且TRIM21與MAVS也具有相互作用。為了探究MGF360-14L蛋白、TRIM21和MAVS三者之間的相互作用，將TRIM21-Myc和MAVS-Flag質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，或者不同濃度的MGF360-14L-eGFP與TRIM21-Myc和MAVS-Flag表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Co-IP競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，MAVS與TRIM21結(jié)合，在轉(zhuǎn)染MGF360-14L質(zhì)粒后，MAVS能與MGF360-14L互作，且MGF360-14L存在時(shí)MAVS與TRIM21的互作被減弱(圖4A)。將TRIM21-Myc、MAVS-Flag和Ub-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞或者M(jìn)GF360-14L-eGFP、TRIM21-Myc、MAVS-Flag和Ub-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，TRIM21能夠促進(jìn)MAVS的泛素化，MGF360-14L對(duì)TRIM21促進(jìn)MAVS的泛素化有抑制作用(圖4B)。綜上所述，作者推測(cè)MGF360-14L通過(guò)與TRIM21競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MAVS，抑制了TRIM21誘導(dǎo)的MAVS的泛素化，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

A. 將ASFV MGF360-14L-eGFP、MAVS-Flag和TRIM21-Myc蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行Co-IP和Western blot檢測(cè)；B. 將MGF360-14L-eGFP、MAVS-Flag、RIM21-Myc和Ub-HA蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，進(jìn)行Co-IP試驗(yàn)以及Western blot檢測(cè)A. HEK293T cells were transfected with MGF360-14L-eGFP, TRIM21-Myc, MAVS-Flag. Co-IP and Western blot were performed 24 h after transfection; B. HEK293T cells transfected with MGF360-14L-eGFP, TRIM21-Myc, MAVS-Flag and Ub-HA, Co-IP and Western blot were performed 24 h after transfection圖4 ASFV MGF360-14L抑制MAVS的泛素化Fig.4 MGF360-14L inhibits the ubiquitination of MAVS

3 討 論

MGF360-14L為ASFV的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，位于ASFV基因組左側(cè)可變區(qū)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)缺失強(qiáng)毒株Georgia/2007的6個(gè)MGF基因(包括MGF360-14L)，以及缺失強(qiáng)毒株ASFV HLJ/18的7個(gè)基因(包括MGF360-14L)后，缺失株ASFV-G-MGF和HLJ/18-7GD免疫豬均能完全抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。但僅缺失強(qiáng)毒株Georgia/2007的MGF360-13L和MGF360-14L并未影響ASFV在細(xì)胞上的復(fù)制水平和對(duì)豬的致病性，提示MGF360-14L可能不是ASFV的毒力基因。但我們的前期研究結(jié)果表明，MGF360-14L能夠與IRF3互作，并通過(guò)招募TRIM21介導(dǎo)IRF3的K63位多聚泛素化，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生，由此推測(cè)MGF360-14L可能參與ASFV逃避宿主先天性免疫系統(tǒng)，促進(jìn)ASFV的感染。

雖然MAVS作為RNA病毒抑制Ⅰ型干擾素的靶基因，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道某些DNA病毒能與MAVS互作，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。例如，卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)的外膜蛋白ORF33與STING和MAVS互作，招募PPM1G促進(jìn)STING和MAVS的去磷酸化，從而促進(jìn)KSHV逃避先天性免疫反應(yīng)；I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 1, HSV-1)的US11蛋白能夠與RIG-I相互作用，抑制RIG-I和MAVS的互作，從而下調(diào)Ⅰ型干擾素的表達(dá)；人皰疹病毒6B(human herpesvirus 6B, HHV-6B)的U26蛋白能夠降解MAVS，抑制RIG-I/MAVS信號(hào)通路介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)。也有研究表明，在病毒感染過(guò)程中，E3泛素連接酶TRIM21能夠靶向MAVS的K27多聚泛素化，促進(jìn)TBK1的招募，從而上調(diào)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，提高機(jī)體先天性免疫反應(yīng)抵抗病毒入侵。

為了探討MGF360-14L是否通過(guò)MAVS途徑抑制Ⅰ型干擾素，從而逃避宿主先天性免疫系統(tǒng)，本研究采用雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)MGF360-14L對(duì)MAVS誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性的影響，Co-IP和共定位檢測(cè)MGF360-14L與MAVS的互作關(guān)系，及Western blot分析MGF360-14L對(duì)MAVS和TRIM21誘導(dǎo)的TBK1和IRF3磷酸化的影響。研究結(jié)果顯示，MGF360-14L能抑制MAVS所誘導(dǎo)的IFN-β mRNA水平和啟動(dòng)子活性(圖1A、B)。Co-IP試驗(yàn)表明，MGF360-14L與MAVS具有相互作用，但并未進(jìn)行內(nèi)源性的互作研究，而共定位試驗(yàn)顯示，二者存在胞質(zhì)內(nèi)的共定位(圖2A～C)。進(jìn)一步的研究表明，MGF360-14L能夠抑制TRIM21和MAVS共同誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，并且對(duì)MAVS和TRIM21誘導(dǎo)的TBK1和IRF3磷酸化也具有抑制作用(圖3A和B)，作者初步推斷MGF360-14L與MAVS互作從而抑制IFN-β的產(chǎn)生。此外，MGF360-14L可能通過(guò)與TRIM21競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合MAVS，抑制TRIM21對(duì)MAVS的泛素化作用(圖4A和B)。本研究進(jìn)一步探討了MGF360-14L的逃避宿主先天性免疫的作用機(jī)制，為ASF疫苗的研制提供線索。

4 結(jié) 論

非洲豬瘟病毒MGF360-14L通過(guò)與MAVS互作，抑制了TRIM21誘導(dǎo)的MAVS的泛素化，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。